RKIP的克隆、表达及其影响肿瘤细胞迁移性质的初步研究

皮亚洲，华子春

(南京大学 医药生物技术国家重点实验室，江苏 南京 210093)

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

表达载体pET28a(+)购自Novagen公司，克隆菌株Top10和表达菌株BL21(DE3)由本实验室提供。限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ、PCR试剂、Pyrobest DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司。柱离心式胶回收小提试剂盒和柱离心式质粒小提试剂盒购自上海申能博彩公司。

1.2 实验方法

1.2.4 RKIP在细胞外对肿瘤细胞迁移的影响 首先将A549细胞接种到6孔细胞培养板中，生长24 h，单层细胞融合度达到80%左右。用新的200 μl枪头在各组细胞中划痕，记录此时(0 h)各组细胞划痕宽度(单位为像素)。具体测量方法为：在显微镜下，每个孔取3个不同的视野，测量各个视野下划痕的垂直距离，细胞划痕间距取3个垂直距离的平均值。以牛血清白蛋白(BSA)作为对照，设定不同的蛋白浓度梯度：不加药组作为空白对照，其余各组蛋白终浓度为50、100、200、400 ng·ml-1。将各组蛋白浓度依次调节至设定浓度，细胞生长48 h后再次记录各组细胞划痕间距(单位为像素)。

2 实验结果

2.1 PCR扩增RKIP基因

按照标准反应体系PCR扩增得到RKIP基因片段，PCR所得产物使用DNA琼脂糖凝胶电泳进行分离，结果表明基因大小正确(图1),为562 bp，之后从凝胶中切割并回收。

M.DNA标记DL2000； 1.RKIP基因片段

图1RKIP的PCR扩增产物

Fig1ThePCRproductofgeneencodingRKIP

2.2 重组质粒pET28 RKIP的构建与鉴定

RKIP基因片段经PCR扩增和双酶切，然后与双酶切的pET28a(+)载体连接，转化进预先制备的Top10感受态细胞，挑取单克隆菌落经双酶切鉴定(图2)，最后通过DNA测序分析显示RKIP片段插入载体中，并且其阅读框序列保持不变。

2.3 Hi RKIP的表达与纯化

2.4 不同浓度的RKIP在细胞外对细胞迁移的影响

由于在0 h的划痕距离不能保证一致，采用间距变化的百分比可以抵消这一不同因素的影响，图4为不同蛋白浓度下各组细胞划痕间距变化百分比情况。

3 讨 论

M.蛋白质标记； 1.细菌超声后沉淀； 2.细胞超声后上清； 3.穿过液； 4.250 mmol·L-1咪唑洗脱液收集液； 5.去除咪唑后的收集液

t检验，n=3； aP<0.05； bP<0.01

图4不同BSA和RKIP浓度下划痕间距变化

Fig4ThewoundhealingchangesunderdifferentconcentrationofRKIPandBSAprotein