TRPM7参与AngⅡ对心肌细胞镁离子平衡的调节

郭瑞娜，李小青，沈之君

(南通大学医学院 病理学与病理生理学系，江苏 南通 226001)

TRPM7是新近发现的具有离子通道和蛋白激酶双重结构的双功能膜蛋白，归属于TRPM(transient receptor potential melastatin， 一过性感受器电位通道)超家族。 TRPM7广泛表达于哺乳动物多种组织器官中，参与体内镁离子的平衡与代谢。在某些心脏病患者中，TRPM7功能低下可能影响心室肌的传导和复极化[1]。在房颤患者的心房肌细胞中，TRPM7的功能出现显著上调[2]。

AngⅡ通过作用于靶细胞膜的AT1(AngⅡ的Ⅰ型)或AT2(AngⅡ的Ⅱ型)受体，参与对血压及心脏功能的调节。血清AngⅡ长期增高可通过系统和局部作用影响心血管功能，引起高血压、心肌肥大、心肌炎症、氧化应激及纤维化等，在心肌重塑和心功能衰竭中起重要作用[3- 4]。

虽然TRPM7和AngⅡ均参与心肌功能的调节，但是两者之间的关系迄今尚无文献报道。本研究探讨TRPM7是否参与了AngⅡ对心肌细胞镁离子平衡的调节。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验ICR鼠由南通大学实验动物中心提供。动物实验中的操作方案及步骤符合南通大学动物实验中心的规范和要求。动物在密闭的气室中CO2麻醉后迅速断头，开胸取出心脏，用心尖部的心室肌组织作进一步实验。

1.2 细胞培养

取出生1 d小鼠的心尖部组织，D- Hanks液漂洗3遍，用解剖剪将组织剪碎。剪碎的心肌组织加入0.25%胰酶(Trypsine，Invitrogen)，于37 ℃的水浴锅中孵育10 min,然后加入DMEM培养基终止胰酶的作用，移至离心管中在室温下离心(1 000 r·min-1，10 min)，弃上清，再次加胰酶进行孵育和离心分离，重复2～3次。将分离好的细胞在37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中预培养1.5 h以减少成纤维细胞。取未贴壁的细胞在6孔培养板中进一步培养，培养基为DMEM，细胞密度约为1×106。

1.3 实验分组及细胞内游离镁离子动态监测

取分离的小鼠心肌细胞，加入有盖玻片的6孔培养板中进行原代培养，培养基为DMEM液。培养24 h后用D- Hanks漂洗，在低镁孵育液中孵育4 h后备用。经低镁孵育后的细胞分对照组(空白的低镁孵育液)、AngⅡ组(100 nmol·L-1)、AngⅡ+Losartan组(100 nmol·L-1)及AngⅡ+2- APB组(500 μmol·L-1)，上述试剂均购自Sigma- Aldrich公司，按产品说明书配制后直接加入相应的低镁孵育液中。各组孵育时间均为2 h。孵育结束后按镁离子荧光探针mag- fura- 2产品说明书(Invitrogen)进行胞内镁离子标记。从荧光探针标记到实验结束的时间不超过2 h。

将载有培养细胞的盖玻片从6孔板中转移入记录浴槽，进行细胞内镁离子动态检测，记录浴槽安置在正置显微镜的观察平台上(Olympus，BX51)并保持持续灌流，滴速为40～50滴·min-1。mag- fura- 2镁离子荧光探针信号用TTL- 1(Polychrome V，德国)进行双波激发(波长在340 nm和380 nm之间快速切换)，用CCD相机(C10600，日本)实时观察和记录510 nm的荧光强度。数据存储于连线的计算机硬盘中供离线分析。各组细胞先在0.2 mmol·L-1低镁孵育液灌流下观察胞内荧光信号，待其稳定后开始记录。记录至120 s后换为1.2 mmol·L-1生理镁孵育液灌流，再记录至1 800 s后再换成10 mmol·L-1高镁孵育液灌流，继续记录1 800 s后结束实验。每个细胞的数据在统计时记作n=1。mag- fura- 2荧光探针应用原理是观察胞内荧光探针在340 nm(荧光探针与钙离子结合)和380 nm(荧光探针未结合钙离子)光源激发下其510 nm荧光强度比值(340/380比值)的变化来描述胞内游离镁离子浓度的相对变化，比值升高提示胞内游离镁离子上升，比值下降则提示胞内游离镁离子下降。因此，为了便于组内数据统计和组间数据的比较，我们把每个细胞在0.2 mmol·L-1低镁孵育液中的340 nm/380 nm比值为基线，分别进行标准化后再作统计分析，实验结果采用t检验。

1.4 实时定量PCR

以出生15 d的小鼠心室肌组织或原代培养心肌细胞为样本，用Trizol Reagent it(美国Invitrogen公司) 提取样本总RNA，用TaqMan Probe Assay kit(日本TaKaRa公司) 在Real- time PCR扩增仪(美国ABI)进行实时定量PCR(95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸60 s。共40个循环，每个循环退火末期检测荧光信号)。小鼠TRPM7 PCR引物：上游5′CTGCCAATCTAGGAGAAGATGCAAT3′；下游引物：5′AGGCGTGTAGTCATTCCTCTTCAAA3′。每组实验重复3次。实验结果采用t检验。

1.5 Western Blotting检测

将6孔培养板自培养箱内取出，置于冰上，用PBS漂洗心肌细胞后每孔加入100 μl的蛋白裂解液(内含1 μl的蛋白酶抑制剂)进行处理。然后在4 ℃下进行离心(13 000 r·min-1，25 min)，用BCA法测上清中总蛋白浓度，根据每个样本的总蛋白浓度计算其上样量，使各样本间的总蛋白量保持一致。用10%的PAGE胶电泳分离后转至PVDF膜上，用3%的BSA封闭1 h后加Ⅰ抗Rabbit anti- TRPM7 (以色列Alomone公司)，β- actin(美国Abcam公司)；4 ℃过夜后用TBST洗膜3次，每次10 min，然后加Ⅱ抗 (Goat anti- rabbit，美国Santa Cruze公司)后在室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加ECL，用凝胶成像系统显影。每组实验重复3次。凝胶成像使用灰度统计分析，实验结果采用成组t检验。

2 结 果

2.1 AngⅡ对心肌细胞镁离子平衡的影响

本实验观察到，当对照组的0.2 mmol·L-1低镁孵育液换成1.2 mmol·L-1生理镁离子孵育液后，胞内mag- fura- 2的荧光强度比值出现了先快速小幅度上升，在到达最大值(1.2 mmol·L-1Peak)后转为缓慢下降，在1.2 mmol·L-1低镁孵育液结束前(1.2 mmol·L-1End)基本回到最初的水平。在10 mmol·L-1高镁孵育液中，这种缓慢下降的趋势逐渐消失，在10 mmol·L-1高镁孵育液结束前(10 mmol·L-1End)比0.2 mmol·L-1低镁孵育液的比值略低(图1A)，各组mag- fura- 2的荧光强度比值平均值见图1B，经统计，这些变化差异无统计学意义(图1C)。

AngⅡ组mag- fura- 2荧光强度比值在1.2 mmol·L-1及10 mmol·L-1中均呈下降的趋势(图1A)。经统计，这些变化与对照组比较差异有统计学意义，并且Ang Ⅱ组内0.2 mmol·L-1End、1.2 mmol·L-1Peak、1.2 mmol·L-1End、10 mmol·L-1End间比较差异也有统计学意义(图1B、C)。AngⅡ诱导的mag- fura- 2荧光强度比值变化可以分别被Losartan或2- APB抑制(图1A、B)。AngⅡ+Losartan组和AngⅡ+2- APB组的mag- fura- 2荧光强度比值在不同的细胞外镁离子浓度条件下也出现了有统计学意义的下降(图1C)。

aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001

A.各实验组的细胞内mag- fura- 2的荧光强度比值变化实时动态监测平均值；B.各组mag- fura- 2的荧光强度比值平均值;C.各组mag- fura- 2的荧光强度比值平均值

图1各组动态荧光强度比值

2.2 AngⅡ对心肌细胞TRPM7表达水平的影响

我们观察到AngⅡ诱导了心肌细胞游离镁离子下降，并且这种下降可以被TRPM7通道阻断剂2- APB抑制。这就说明了TRPM7可能参与了Ang Ⅱ介导的镁离子外流。因此，我们进一步检测了Ang Ⅱ对TRPM7表达量的影响。通过qPCR和Western Blotting方法，我们发现Ang Ⅱ没有影响原代培养心肌细胞中TRPM7的表达(图2)。

A.小鼠原代心肌细胞TRPM7 mRNA的统计图(n=3)；B.小鼠原代心肌细胞TRPM7蛋白的电泳图及统计图(n=3)

图2AngⅡ对心肌细胞TRPM7表达的影响

3 讨 论

我们应用镁离子荧光探针技术，首次证明了AngⅡ在原代培养心肌细胞中诱导了胞内游离镁离子下降，而阻断TRPM7通道则可以显著抑制这种变化。进一步的分子生物学实验表明，AngⅡ对心肌细胞中TRPM7的表达量没有影响。因此，我们的研究提示，AngⅡ可能增强了心肌TRPM7通道对镁离子的转运功能。有文献报道，短时间(5 min)以AngⅡ孵育野生型大鼠的血管平滑肌细胞可以导致胞内Mg2+浓度显著降低，长时间孵育(24 h)则可以观察到TRPM7依赖的Mg2+内流，胞内游离Mg2+浓度显著增加。这种TRPM7依赖性的Mg2+内流可能与AngⅡ诱导的胞内Mg2+浓度持续下降所致的TRPM7反馈性表达增加有关[5]。而Ang Ⅱ 孵育自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞可诱导TRPM7表达下降，进而出现使胞内游离Mg2+显著降低[6]。此外，我们的实验数据还显示，阻断TRPM7通道并不能完全抑制AngⅡ诱导的镁离子下降，提示可能有其他镁离子转运体的参与的可能性。

通过实验我们还观察到，使用AT1受体阻断剂并不能完全抑制Ang Ⅱ诱导的心肌细胞镁离子下降。因此，AT1可能参与了AngⅡ对心肌细胞镁离子的调节，但也不能排除AT2受体参与AngⅡ 对心肌细胞镁离子调节的可能性。据文献记载，AT1具有激活心肌细胞增殖、促进心肌纤维化和诱发心肌肥大等作用[7]， AT2受体主要介导心肌肥大时炎症细胞因子表达[8]。但是，AT1受体与TRPM7通道的关系在我们目前的实验数据中尚不明确。虽然目前已知TRPM7蛋白有多个磷酸化位点，而且TRPM7可以通过自身磷酸化来调节其功能[9]。但是，目前文献中尚无AT1受体介导的TRPM7蛋白磷酸化的报道。

本实验证明，AngⅡ可以通过心肌细胞的TRPM7通道下调心肌细胞内游离镁离子水平。而临床资料提示，镁离子不足可能使心脏在高血压、炎症和缺血等诱因下更容易受损。我们的实验为临床上应用AngⅡ受体阻断剂治疗高血压、心肌肥大、心律失常等疾病提供了新的思路。

[1] SAH R，MESIRCA P，MASON X，et al.Timing of myocardial trpm7 deletion during cardiogenesis variably disrupts adult ventricular function，conduction，and repolarization[J].Circulation，2013,128(2):101- 114.

[2] SHI J，ZHANG L，ZHANG Y W，et al.Downregulation of doxorubicin- induced myocardial apoptosis accompanies postnatal heart maturation[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol， 2012,302(8):H1603- 1613.

[3] BUNKENBURG B，van AMELSVOORT T，ROGG H，et al.Receptor- mediated effects of angiotensin Ⅱ on growth of vascular smooth muscle cells from spontaneously hypertensive rats[J].Hypertension,1992,20(6):746- 754.

[4] NAKAGAMI H，TAKEMOTO M，LIAO J K.NADPH oxidase- derived superoxide anion mediates angiotensin Ⅱ- induced cardiac hypertrophy[J].J Mol Cell Cardiol,2003,35(7):851- 859.

[5] YOGI A，CALLERA G E，ANTUNES T T，et al.Transient receptor potential melastatin 7 (TRPM7) cation channels，magnesium and the vascular system in hypertension[J].Circ J，2011,75(2):237- 245.

[6] TOUYZ R M，HE Y，MONTEZANO A C，et al.Differential regulation of transient receptor potential melastatin 6 and 7 cation channels by ANG Ⅱ in vascular smooth muscle cells from spontaneously hypertensive rats[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2006,290(1):R73- 78.

[7] AKAZAWA H，KOMURO I.Angiotensin Ⅱ type 1 and type 2 receptor[J].Nihon Rinsho,2009,67(4):687- 694.

[8] ZHOU J，XU X，LIU J J，et al.AngiotensinⅡtype 2 receptors participate in the regulation of inflammatory cytokine secretion in adult rat hypertrophied cardiomyocytes[J].Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao,2008,28(11):1971- 1973.

[9] TAKEZAWA R，SCHMITZ C，DEMEUSE P，et al.Receptor- mediated regulation of the TRPM7 channel through its endogenous protein kinase domain[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(16):6009- 6014.