双调控溶瘤腺病毒对膀胱肿瘤EJ细胞的杀伤作用

陈波， 史振铎， 邱祥政， 韩从辉

(东南大学医学院附属徐州医院 泌尿外科，江苏 徐州 221009)

膀胱癌是我国泌尿系统中最常见的肿瘤，目前治疗的主要方法是手术切除后膀胱灌注化疗药或免疫治疗药物，但仍有较高的复发率，其中膀胱灌注卡介苗(BCG)的免疫治疗效果最佳，但由于BCG具有较大的毒副作用而限制了其在临床上的应用。我们曾构建由人端粒酶启动子(hTERT)和缺氧诱导因子启动子(HIF)双向调控的携带SEA基因的选择性增殖腺病毒，该腺病毒可以在鼠膀胱癌细胞内表达SEA蛋白[1]。本研究观察该腺病毒对膀胱癌的抑制效果，为膀胱癌临床治疗方法的探索提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

膀胱肿瘤EJ细胞、蛋白提取试剂盒购自上海爱博生物医药科技有限公司。总RNA提取试剂盒购自Omega公司。反转录试剂盒购自上海闪晶分子生物科技有限公司。RT-PCR引物合成于上海卓康生物科技有限公司。SEA单克隆抗体购自Sigma公司。FITC标记的羊抗兔抗体购自上海史瑞可生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 共培养 分别计数1×107个EJ细胞加入培养瓶中培养，待细胞贴壁后向其中1瓶加入20 μl病毒液转染细胞。12 h给细胞换液1次，取5 ml新鲜血液加入无菌离心管与PBS按1∶1比例混匀，平均缓慢加入两只装有5 ml人淋巴细胞分离液的无菌离心管中，1 500 r·min-1、20 ℃离心10 min，用5 ml注射器小心吸取白色雾状层，加入离心管，1 000 r·min-1离心5 min，弃去上清，PBS洗1次，计数1×106个细胞，分别加入两个细胞培养瓶中，动态观察细胞变化。

1.2.2 体外抗肿瘤活性测定 取效应细胞淋巴细胞、靶细胞及感染溶瘤腺病毒靶细胞(1×104个)，调整效靶比40∶1、20∶1、10∶1接种于96孔板。实验组加淋巴细胞与感染溶瘤腺病毒膀胱癌EJ细胞，靶细胞组加EJ细胞，效应细胞组加单纯淋巴细胞，每组设3个复孔，37 ℃、体积分数5%的CO2孵育。同法种3板。孵育12、24和48 h时取1板，应用MTT法检测各孔OD值，按下述方法计算淋巴细胞杀伤率：

ODE+T=效应细胞+靶细胞孔OD值；ODE=相应浓度单独效应细胞的OD值；ODT=相应浓度单独靶细胞的OD值。

1.3 统计学处理

应用SPSS 14.0软件，用配对t检验、多因素方差分析对结果进行统计分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 感染溶瘤腺病毒膀胱癌EJ细胞与淋巴细胞共培养

见图1。

A.阴性(单纯EJ细胞与淋巴细胞共培养)组 ×10； B.阳性(感染溶瘤腺病毒的EJ细胞与淋巴细胞共培养)组 ×10； C.阴性组 ×40； D.阳性组 ×40

图1显微镜下感染溶瘤腺病毒膀胱癌EJ细胞与淋巴细胞共培养48h

Fig1UnderthemicroscopeoncolyticadenovirusinfectionofbladdercancerEJcellsandlymphocyteswereculturedfor48h

2.2 转基因淋巴细胞肿瘤杀伤结果

转染超抗原膀胱癌EJ细胞较单纯膀胱癌EJ细胞杀伤率差异有统计学意义(P<0.05)。在时间上3组间差异无统计学意义(P>0.05)；在浓度上10∶1组较40∶1组差异有统计学意义(P<0.05)，10∶1组较20∶1组及20∶1组较40∶1组差异均无统计学意义(均P>0.05)，故浓度40∶1组杀伤率最高。见表1。

3 讨 论

迄今为止发现的最强的超抗原是T细胞丝裂原，能够在较低的浓度下刺激T淋巴细胞分裂。SEA作为超抗原的一员，以完整形态结合到抗原提呈细胞(APC)表面表达MHCⅡ类分子的抗原合沟槽的外侧，而后与T细胞受体(TCR) 的β链V区结合，导致T淋巴细胞大量增殖。腺病毒是一种中等大小的病毒，直径70～90 nm，无包膜，呈20面体立体对称[2-3]。迄今为止，已发现人腺病毒51种血清型，并分为A、B、C、D、E、F 6个亚群。不同腺病毒因其亲嗜性不同表现出特定的器官选择性。普通腺病毒对人体正常组织具有不稳定的感染能力，导致人患各种腺病毒引发的疾病。溶瘤病毒是一类具有特殊感染和裂解肿瘤细胞能力，并且对正常细胞无损伤的病毒，溶瘤腺病毒是通过基因工程对已知生物学特性的腺病毒进行改造得到的，针对肿瘤细胞表面TSA、TAA及高表达分子，在腺病毒基因内加载相关基因获得高效识别和杀伤肿瘤细胞的生物制品[4-5]。

表1淋巴细胞对转染超抗原膀胱癌EJ细胞的杀伤率

Tab1Thekillingrateoflymphocytesforbladdercancercelltransfectedwithsuperantigen

时间组转染超抗原膀胱癌EJ细胞杀伤率/%10∶120∶140∶1单纯膀胱癌杀伤率/%10∶120∶140∶112 h组11.47±0.3027.95±0.4544.75±0.769.76±0.3110.35±0.4414.60±0.8224 h组13.25±0.4537.15±0.4643.86±0.7412.43±0.6513.97±0.6719.65±0.7148 h组12.58±0.5336.52±0.5639.54±0.979.45±0.2913.16±0.3117.98±0.83

文献报道肝癌细胞Hepa1-6感染重组腺病毒AdAFPSEA可活化CD4+和CD8+T细胞，体内试验在肿瘤组织中检测到SEA的表达，肝癌细胞移植瘤被抑制，小鼠生存时间延长，这些结果表明腺病毒携带的SEA能产生强大的局部和全身抗肿瘤作用[6-7]。本研究通过将改造好的溶瘤腺病毒加载上目的基因达到对肿瘤细胞的靶向性杀伤作用。实验结果证实，淋巴细胞与肿瘤细胞的共培养过程中感染与未感染的肿瘤细胞数量存在明显差异，初步证实药物对肿瘤细胞的杀伤效果[8]。

本研究成功改造的溶瘤腺病毒携带目的基因，达到对肿瘤细胞特异性转染的目的，成功地在肿瘤细胞内表达。实验初步解决了在肿瘤治疗过程中的无目标性及靶向治疗膀胱癌，大大减少了对正常组织的损伤。本实验过程中只对比了感染与未感染肿瘤细胞之间的差异，我们正在对此种治疗肿瘤方法的药物代谢学进行进一步的研究。

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