依折麦布对db/db糖尿病小鼠胰岛自身胰岛素信号通路的影响

钟勇，江时森，王俊，邵加庆，卢斌，顾萍

(南京军区南京总医院1.干部保健科，2.心脏内科，3.内分泌科，江苏 南京 210002)

2型糖尿病患者常合并有脂代谢异常，单纯控制血糖不能完全消除糖尿病患者发生冠心病等大血管并发症，因此，在控制血糖的同时，必须进行调脂治疗。研究[1]表明，在合并血脂代谢异常的2型糖尿病患者中，大剂量他汀药物治疗可能会影响患者的血糖控制。依折麦布作为第一种选择性胆固醇吸收抑制剂，可单独或与他汀类药物联合用于治疗2型糖尿病合并高脂血症。临床研究表明，依折麦布不仅可降低血脂，同时可以改善2型糖尿病患者的糖代谢紊乱[2]。动物实验发现依折麦布可以降低胰岛素抵抗肥胖大鼠空腹胰岛素水平及改善高脂诱导的糖耐量异常，但机制尚不完全明确[3]。本研究从依折麦布对db/db糖尿病小鼠胰岛自身胰岛素信号转导通路的影响来探讨依折麦布降血糖的机制。

1 材料与方法

1.1 动物及材料

40只8周龄清洁级雄性db/db小鼠，来自南京军区南京总医院比较医学科实验动物房，体重35～48 g，随机分为两组，每组20只：db/db依折麦布治疗组(依折麦布组)予6周的依折麦布(益适纯，MSP Singapore Company LLC)10 mg·(kg·d)-1，db/db安慰剂对照组(db/db对照组)予安慰剂(5%阿拉伯胶。另20只同周龄同窝出生的db/m小鼠为非糖尿病对照组(db/m对照组)。动物的处置均遵循实验动物看护原则。蛋白质印迹法检测仪Bioshine购自上海欧翔科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生理生化指标检测 每周监测体重和血糖，投药前和投药6周后测定空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、空腹总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、空腹胰岛素(fasting serum insulin，FSI)水平，血糖测定使用强生公司生产的One-Touch 血糖仪。血浆胰岛素测定使用小鼠胰岛素ELISA试剂盒(Morinaga，Yokohama，Japan)。胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index，ISI)的计算采用公式：ISI=ln1/(FBS×FSI)。

1.2.2 胰岛分离及匀浆化 苯巴比妥麻醉后，夹闭胆总管十二指肠乳头开口，胆总管穿刺注射1 g·L-1Ⅳ型胶原酶2 ml，迅速分离胰腺置于含Ⅳ型胶原酶的Hank平衡液中消化40 min，振荡洗涤后分离胰岛。然后将分离的胰岛组织匀浆化。

1.2.3 胰岛素负性调节因子蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的测定 按上述方法提取胰岛，将分离的胰岛匀浆化，经PBS洗2次，使用细胞溶解液(加入1 mmol·L-1的PMSF)消化1 h，离心15 min(4 ℃、12 000×g)，采取上清液放入-80 ℃中保存备用。蛋白质印迹法检测PTP1B含量变化。100 μg细胞溶解物SDS-PAGE 蛋白分离，然后转移至PVDF膜。在室温用PBS液溶解5%脱脂牛奶封膜1 h。加入羊抗鼠PTP1B多克隆抗体(工作浓度1∶4 000)4 ℃孵育过夜，洗涤后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG二抗(工作浓度1∶5 000)分别37 ℃孵育1 h，TBST洗3次。充分洗涤后与ECL(增强化学发光剂，英国Amersham)反应，即刻与KadakX-Omat底片曝光洗片后用LeicaQ550-IW 图像分析仪(德国)进行扫描，测定光密度，进行半定量分析。

1.2.4 葡萄糖转运子(GLUT-2)、葡萄糖激酶(GCK)表达水平的测定 按上述方法提取胰岛中总蛋白质，用蛋白质印迹法检测GLUT-2、GCK。

1.3 统计学处理

采用SPSS 11.0统计软件，结果以均数±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，实验前后的资料比较采用配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 生理生化指标

依折麦布组和db/db对照组的基线FBG、FSI、TG、LDL-C均无明显差异。在8周龄，db/db小鼠的空腹血糖均已超过15 mmol·L-1。依折麦布组在治疗6周后开始出现高血糖进展速度的减缓，6周末时血糖显著低于db/db对照组(P<0.05)。6周末时，依折麦布组TG、LDL-C明显低于db/db对照组(P<0.05)。ISI在基线时依折麦布组和db/db对照组无明显差异，投药6周后显著高于db/db对照组(P<0.05)(表1)。

组 别n体重/gFBG/mmol·L-1FSI/μg·L-1TC/mmol·L-1LDL-C/mmol·L-1ISIdb/m对照组基线2029.10±0.33a5.51±0.53a2.43±0.23a2.65±0.41a1.65±0.22a-2.58±0.15终点2035.80±0.54a5.71±0.63a2.63±0.31a2.55±0.53a1.79±0.27a-2.69±0.19db/db对照组基线2041.20±3.1817.30±3.998.51±1.265.14±0.803.88±0.44-4.95±0.32终点2050.20±4.3225.9±2.009.55±1.205.86±0.854.91±0.37-5.49±0.20依折麦布组基线2040.92±2.8418.37±4.259.01±1.375.30±0.773.69±0.74-5.07±0.34终点2045.40±3.81a18.82±3.99a7.58±0.67a4.21±0.63a2.78±0.62a-4.38±0.24

a 与db/db对照组比较，P<0.05

2.2 PTP1B表达水平的变化

db/db糖尿病小鼠PTP1B的表达水平是db/m对照组小鼠的2倍，依折麦布组治疗后PTP1B表达水平下降至对照组的1.3倍(图1)。

图1依折麦布对db/db糖尿病小鼠胰岛PTP1B表达的影响

Fig1ImpactofezetimibeonPTP1Bexpressionofdb/dbcontrolmice

2.3 GCK和GLUT-2表达水平的变化

与db/m对照组相比，db/db糖尿病小鼠GLUT-2、GCK表达水平明显下降，而依折麦布组GCK和GLUT-2表达水平分别是治疗前的1.5倍和1.8倍(图2)。

3 讨 论

依折麦布是全球第一种选择性胆固醇吸收抑制剂，作用于小肠细胞的刷状缘，通过抑制NPC1Ll(Niemann-Pick C1 like 1 protein) 转运蛋白活性，选择性地抑制膳食和胆汁中的胆固醇跨小肠壁转运到肝脏中，使得肝脏胆固醇储存减少，导致肝脏LDL受体合成增加，加速LDL代谢，使血浆LDL-C水平降低[4]。目前研究发现，依折麦布作用位点NPC1L1转运蛋白不仅在小肠表达，在肝脏、胰腺、胆囊、睾丸、胃亦有表达[5]。目前对肝胰岛素抵抗的研究关注较多，但依折麦布对胰岛的作用及对胰岛素信号转导通路的影响国内外报道甚少。

db/db小鼠是一种先天肥胖性2型糖尿病小鼠模型，由瘦素受体基因发生突变所致。一般于出生后3～4周即可表现为肥胖、血糖升高、胰岛素抵抗等特性，是研究2型糖尿病的理想模型。我们前期的研究在国内首次采用db/db 2型糖尿病小鼠模型，通过依折麦布干预后发现，依折麦布在降低血脂的同时，可以降低血糖，改善葡萄糖耐量及胰岛第一时相分泌，提高胰岛素敏感性，减少胰岛内B细胞的丢失，保护B细胞功能[6]。本研究进一步发现依折麦布一方面可以直接或通过抑制PTP1B的表达间接促进胰岛素受体(IR)、胰岛素受体底物-1(IRS-1)数量及磷酸化水平，来改善胰岛自身的胰岛素抵抗，从而降低血糖；另一方面，它可以上调B细胞GLU-2、GCK的表达，恢复葡萄糖诱导的胰岛素分泌来降低血糖。

图2依折麦布对db/db糖尿病小鼠胰岛GCK和GLUT-2表达的影响

Fig2ImpactofezetimibeonGCKandGLUT-2expressionofdb/dbcontrolmice

研究表明B细胞自身也存在胰岛素抵抗，胰岛B细胞上同样存在胰岛素受体及胰岛素信号转导通路的其他部分如胰岛素受体底物等，B细胞胰岛素信号转导障碍可导致胰岛素分泌缺陷，B细胞对胰岛素的敏感性减低，致B细胞自身胰岛素抵抗[7]。胰岛IR、IRS-1数量减少或磷酸化障碍均都可影响胰岛素信号转导，导致胰岛自身胰岛素抵抗。研究发现，胰岛素信号转导受到正负调节蛋白的协同作用，而在众多负调节因子中PTP1B作用突出。PTP1B是蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的一员，在人体多种组织细胞中普遍存在，主要位于胞浆内质网表面，它通过使激活的胰岛素受体及胰岛素受体底物等去磷酸化失活而发挥生理功能[8]。研究发现PTP1B的表达水平在糖尿病或发生胰岛素抵抗时明显升高。本实验显示依折麦布组治疗后PTP1B表达水平较治疗前下降至对照组的1.3倍，提示依折麦布通过抑制胰岛素信号负性转导因子PTP1B的表达，促进IR及IRS-1的磷酸化水平，从而改善胰岛自身的胰岛素抵抗。

GCK和GLUT-2均是特异性分布在B细胞中，是调节B细胞分泌胰岛素的重要信号因子。GLUT-2是B细胞葡萄糖的转运体，GCK是B细胞的葡萄糖感受器和代谢信息产生器。当体内血糖升高并超过正常范围时，GLUT-2会将葡萄糖转运至胰岛B细胞中，而后由GCK将葡萄糖磷酸化为6-磷酸葡萄糖进入糖酵解及氧化过程，结果使得ATP与ADP的比值增加，细胞内K+通道关闭，膜去极化，电压依赖性Ca2+通道开放，Ca2+内流，胰岛B细胞中存储胰岛素的囊泡与质膜融合，胰岛素释放[9]。释放出的胰岛素通过血液循环至机体其他组织参与血糖调节作用。因此，GCK和GLUT-2表达减少会导致胰岛B细胞分泌胰岛素减少，从而导致糖尿病发生。本研究显示，与db/m对照组相比，db/db糖尿病小鼠GCK和GLUT-2的表达水平明显下降，依折麦布治疗后GCK和GLUT-2的表达分别是治疗前的1.5倍和1.8倍，表明依折麦布通过上调GLU-2、GCK的表达，恢复葡萄糖诱导的胰岛素分泌，降低血糖。

目前公认2型糖尿病的发病机制包括胰岛素抵抗及胰岛素分泌下降。本实验表明，依折麦布可以从改善上述两个发病机制来改善db/db小鼠的糖代谢，表现出其对糖尿病状态下调脂作用以外的优势。糖尿病合并冠心病等大血管并发症的发生率较高，此时往往需要强化调脂治疗来达到降低心肌梗死、中风等不良事件发生率的目的。本研究提示，依折麦布因其改善糖代谢改善作用，在糖尿病合并高脂血症的患者中可能有更加广阔的应用前景。

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