吡格列酮对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用机制

余 智 廖小明 唐永刚 齐 立 孙 军 刘开祥

(杭州市淳安县第一人民医院神经内科，浙江 杭州 311700)

吡格列酮(PGZ)是一种人工合成的胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药，临床上广泛应用于2型糖尿病的治疗。目前有报道提示PGZ能通过激活PPARγ抑制炎症等过程，从而对脑缺血再灌注损伤具有一定的神经保护作用〔1〕。但关于PPARγ激动剂的神经保护作用机制尚未完全阐明。本实验采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，应用PGZ进行预处理，观察其对大鼠术后神经功能及脑含水量、炎症反应和细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1动物分组 清洁级SD雄性大鼠120只，重量250～280 g。术前12 h禁食不禁水，随机(随机数字法)分为5组，每组各24只：①假手术组；②模型组；③PGZ组；④GW9662+PGZ组(GP组)；⑤二甲基亚砜(DMSO)组。

1.2试剂 PGZ、GW9662和10% DMSO(Sigma公司，美国)；核转录因子(NF)-κB及干扰素(IFN)-γ ELISA试剂盒(R&D Systems公司，美国)；甲苯胺蓝(国药集团)、原位末端标记(TUNEL)试剂盒(Promega公司)；Labo fuge 400R高速低温离心机(Heraeus公司，德国)，多功能酶标仪(BioTek公司，美国)，电子显微镜(OLYMPUS，日本)等。

1.3动物模型制备及处置 模型组：术前45 min经尾静脉注射生理盐水2 ml/kg，采用改良的Zea-Longa〔2〕法制备大鼠大脑中动脉阻断(MCAO)模型：麻醉成功后，取颈部左旁正中切口，暴露左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，结扎并游离ECA的近端，将蛙心夹夹闭CCA和ICA后在ECA游离段上剪开一个小口将制备好的尼龙线栓经CCA分支处通过ICA入颅，线栓深度为18～19 mm。缺血90 min后抽出线栓即可造成再灌注模型。PGZ组：术前45 min经尾静脉注射PGZ10 mg/kg。GP组：术前45 min先经尾静脉注射GW9662，剂量是0.3 mg/kg〔3〕，10 min后再经尾静脉注射吡格列酮10 mg/kg。D组：术前45 min经尾静脉注射10%DMSO 2 ml/kg。假手术组：术中分离左侧CCA、ICA及ECA，但不做任何缺血处理。

1.4指标检测

1.4.1神经功能评分 再灌注24 h后采用双盲法严格按Zea-Longa 5分法进行神经功能评分。

1.4.2脑含水量检测 再灌注24 h后随机抽取各组8只大鼠，立即断头取脑，去除小脑及低位脑干后快速用精密天平称取湿重，然后烘至恒重，称取干重，将(湿重-干重)/湿重×100%作为脑含水量的指标。

1.4.3NF-κB及IFN-γ含量水平测定 再灌注24 h后，各组再随机抽取8只大鼠，迅速断头取脑。于冰上在距额叶前端3 mm和9 mm处进行冠状分离，取中间6 mm厚的脑组织块，然后沿此脑块矢状缝两侧约2 mm处，从上至下切去两侧半球的正中结构，将左侧脑块作为缺血脑组织。严格按ELISA试剂盒检测要求进行操作。

1.4.4HE染色 将各组其余8只大鼠麻醉，以4℃生理盐水进行心脏快速灌洗，予多聚甲醛灌洗充分固定，并以同样的方法取得缺血脑组织，制成蜡块。自前往后连续冠状位切片，厚约5 μm。HE染色光学显微镜下(×400)观察神经细胞形态学变化并采图。

1.4.5尼氏染色及TUNEL染色 严格按照试剂盒检测步骤进行操作。尼氏染色在光镜(×400)下观察健存神经元(以尼氏小体为代表)的数量，计算尼氏小体的数目/相应的面积并采图。TUNEL染色在光镜下(×400)观察凋亡细胞(以胞核出现棕黄染色颗粒代表)，计算TUNEL阳性率即TUNEL阳性细胞数占总细胞数的比值并采图。

2 结 果

2.1各组大鼠一般状况及神经功能 与模型组相比，经PGZ预处理的大鼠神经功能评分明显降低(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠一般状况及神经功能(n=24)

2.2脑组织含水量 与模型组相比，PGZ组大鼠含水量明显降低(P<0.01)。5组大鼠脑组织含水量的比较见表2。

2.3NF-κB、IFN-γ含量水平及相关性分析 与模型组比较，PGZ组大鼠NF-κB及IFN-γ含量水平均显著降低(P<0.05)。两组脑组织NF-κB与IFN-γ含量水平均呈显著正相关，回归方程模型组=-0.432+0.271x，rM=0.947(P<0.001),PGZ组=-4.168+0.748x，rP=0.961(P<0.001)。见表2。

2.4HE染色 切片经HE染色后，光镜下可见模型组呈明显的缺血损伤性改变，多数细胞体积缩小，正常组织结构消失，胞质疏松，胞核固缩深染，部分细胞坏死。PGZ组缺血性损伤改变较模型组明显减轻，细胞膜较完整，间质水肿减轻，坏死区域缩小。

2.5尼氏染色及TUNEL染色 假手术组尼氏小体多且体积大，呈紫色分布于核周围，且只有少量凋亡细胞。模型组尼氏小体数量明显减少，且变小或变形〔(63.06±9.05)%〕，而PGZ组相应区域尼氏体数量较多且变形较少〔(48.10±7.61)%〕,两组相比差异也有统计学意义(P<0.01)。见表2，图1。

表2 各组大鼠脑组织含水量、 NF-κB、IFN-γ含量、尼氏小体平均数值及凋亡细胞数

A：假手术组 B：模型组 C：PGZ组 D：DMSO组 A1：假手术组 B1模型组 C1：PGZ组 D1：DMSO组(A～D:尼氏小体染色；A1～D1：TUNEL染色)

3 讨 论

近期研究表明，脑缺血再灌注时神经细胞释放大量炎症信号，介导大量炎性细胞的聚集和炎性因子的释放〔4〕，加重缺氧直接造成的神经元坏死和凋亡，从而放大对缺血损伤区域细胞甚至是机体的损伤。本研究也已证实，减轻炎症反应可抑制脑缺血再灌注损伤所致的细胞凋亡〔5〕。炎症反应的要素包括信号传导分子、炎症细胞、黏附分子和转录因子。NF-κB属于NF-κb/Rel家族蛋白的一员，能够启动基因转录，从而参与一系列基因的调控和表达，在炎症反应、免疫应答、细胞凋亡调控等方面发挥重要作用。本实验结果表明脑缺血后诱导释放NF-κB而促进IFN-γ的表达。本实验结果与Xu 等〔6〕研究报道基本一致。此外，有研究表明IFN-γ可活化P38激酶，诱导细胞因子及Ⅱ类组织相容性复合体(MHC)的表达，共同参与细胞的凋亡〔7〕。本研究也发现模型组中IFN-γ的含量水平及细胞凋亡数量相比假手术组显著升高，我们推测IFN-γ在脑缺血再灌注损伤后形成细胞凋亡过程中发挥至关重要的作用。

有研究发现，PPARγ激动剂能活化细胞外信号调节激酶而抑制NF-κB的激活〔8〕。国内有研究报道，PGZ作为PPARγ特异性激动剂，可促进PPARγmRNA和蛋白的表达，增强其对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用〔9〕。本实验发现PGZ可通过降低诱发NF-kB的释放能力，进而减少促炎介质(IFN-γ)的含量水平，从而发挥增加健存神经元而减少细胞凋亡的作用；若先给予GW9662〔10〕后再予PGZ处理，则可逆转PGZ的上述保护作用；同样，单独行DMSO预处理后的大鼠在相关方面未得到明显的改善。

本文提示PGZ具有阻止或延缓神经细胞水肿坏死，对保护缺血再灌注后神经细胞损伤具有积极意义，而GW9662则可逆转PGZ抗细胞水肿坏死的效应。

本研究结果表明，吡格列酮可通过激活PPARγ负性调节脑组织中NF-κB的含量水平，进一步减少促炎介质(IFN-γ)的释放，减轻了大鼠缺血再灌注后的细胞水肿，从而很好地增加健存神经元而减少细胞凋亡。

4 参考文献

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2Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989；20(1)：84-91.

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4A.Denes P，Thornton NJ，Rothwell,etal.Inflammation and brain injury：acute cerebral ischaemia，peripheral and central inflammation〔J〕.Brain Behav Immun，2010；24(5)：708-23.

5吴 岚，周素娴，刘开祥.青藤碱对糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤后BCl-2和caspase-3表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2010；30(11)：1543-5.

6Xu H，Tang Y，Liu DZ,etal.Gene expression in peripheral blood differs after cardioembolic compared with large-vessel atherosclerotic stroke：biomarkers for the etiology of ischemic stroke〔J〕.Cereb Blood Flow Metab，2008；28(7)：1320-8.

7Schindle C，Shuai K，Prezioso VR,etal.Interferon-dependent tyrosine PhosPhorylation of alatent cytoplasmic transeription factors〔J〕.Science,1992；257(5071)：809-13.

8Chen F，Wang MO,Connor JP，etal.Phosphorylation of PPARgamma via active ERKI/2 leads to its physical association with P65 and inhibition of NF- kappabeta〔J〕.J Cell Biochem,2003；90(4)：732-44.

9刘尊敬，杨期东，刘运海，等.脑梗死患者周围血淋巴细胞PPARγmRNA动态变化〔J〕.中风与神经疾病杂志，2004；21(6)：521-2.

10Kamada N，Calne RY.Orthotopic liver transplantation in the rat.Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage〔J〕.Transplantation，1979；28(1)：47-50.