CXC趋化因子配体5对前列腺癌细胞生长的作用

齐亚灵 王伟群 张建华 赵晓莲 张 坤 于海波 贾秀月 齐淑芳 邵明亮

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

前列腺癌发病率具有明显的地理和种族差异。在欧美国家，前列腺癌的发病率最高，并且其病死率也仅次于肺癌，位于第二位。我国前列腺癌发病率每年以10%的速度快速增加。肿瘤的分子病理学机制错综复杂，多种生物分子都参与其发生与演进过程，目前众多的研究已经证实趋化因子及其受体在肿瘤的众多生物学中扮演着重要角色〔1〕。趋化因子是一类能使细胞发生趋化作用的细胞因子，其可通过趋化因子受体广泛参与细胞的生长、发育、分化、凋亡等多种生理功能，并在多种病理过程中如肿瘤的生长、存活、迁移、血管发生、白细胞浸润等发挥重要作用。本研究探讨CXC趋化因子配体(CXCL)5受体(CXCR2)在前列腺癌细胞的表达及CXCL5对前列腺癌细胞生长的作用。

1 材料与方法

1.1实验用细胞、试剂及仪器 PC-3、DU145及LNCaP细胞(美国ATCC)；RPMI1640 培养基、优质胎牛血清及胰蛋白酶(美国Gibco公司)； RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所公司)；重组人CXCL5(美国PeproTech公司)；鼠抗人β-actin抗体、兔抗人CXCR2抗体(美国Santa Cruz公司)；青、链霉素、山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP、ECL显影液(武汉博士德生物工程有限公司)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美国Millipore公司)；EPS100 、EPS300电泳仪、垂直电泳槽、转膜仪(上海天能科技有限公司)；全自动酶标仪(美国Biotek公司)。

1.2Western印迹检测CXCL5 受体CXCR2在前列腺癌细胞中的表达 PC-3、DU145及LNCaP前列腺癌细胞接种于RPMI1640 培养基中(血清含量及双抗浓度分别为10%和100 U/ml )，并培养于CO2浓度为5%的37℃培养箱中。待细胞融合度达到80%以上后，收集细胞，RIPA裂解液裂解细胞，BCA方法测定各细胞株蛋白浓度。将30 μg总蛋白于12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳后，转移至PVDF膜(270 mA 1 h)；5%脱脂奶粉室温封闭2 h； PBST洗膜5 min×3次；鼠抗人β-actin(1∶500)抗体或兔抗人CXCR2抗体(1∶200)4℃孵育过夜；PBST洗膜10 min×3次；山羊抗小鼠IgG-HRP(1∶4 000)或山羊抗兔IgG-HRP(1∶4 000)37℃孵育45 min；PBST洗膜15 min×3次；ECL显影液孵育膜2～3 min后置于暗盒中曝光，调整曝光时间并进行显影和定影。实验重复3次，以PC-3细胞β-actin条带的灰度值为1，计算各条带灰度值。各细胞株CXCR2与其内参actin灰度值之比代表各细胞株CXCR2蛋白的相对含量。

1.3MTT法检测重组人CXCL5对LNCaP细胞生长作用的影响 重组人CXCL5用0.1%BSA溶解并稀释至适当浓度，冻存于-80℃冰箱中备用。将对数生长的LNCaP细胞用RPMI1640培养基(血清含量及双抗浓度分别为5%和100 U/ml)接种于96孔板中，1.5×103个/孔。次日，将96孔板中的细胞分为4组(对照组与实验组)，每组6孔。对照组用上述培养基+0.1%BSA培养(CXCL5终浓度为0 ng/ml)；实验组用上述培养基+CXCL5培养(实验组CXCL5终浓度分别为5，10，20 ng/ml)。从加入CXCL5后培养至第3天，各组细胞换各自的培养基继续培养，至第6天用MTT法检测细胞增殖情况。

1.4统计学分析 使用SPSS19.0统计学软件进行q检验。

2 结 果

2.1CXCR2蛋白在前列腺癌细胞中的表达情况 CXCR2在DU145和LNCaP细胞中表达量较高，而在PC-3细胞中其表达量则较低，PC-3、DU145和LNCaP细胞目的基因蛋白CXCR2与内参actin灰度值之比分别为0.36±0.056，1.44±0.107，1.65±0.089(P<0.05)(图1)。

图1 CXCR2蛋白在前列腺癌细胞的表达

2.2重组人CXCL5促进LNCaP细胞的生长 对照组及5、10、20 ng/ml组细胞的吸光度值分别为0.52±0.14，0.55±0.06，0.61±0.08和0.73±0.10。与对照组比较，20 ng/ml组增长率明显增高(P<0.05)，这说明CXCL5可以明显促进前列腺癌细胞LNCaP的增殖。

3 讨 论

趋化因子是一类可介导细胞迁移、细胞激活、细胞分化和血管发生等多种功能的小分子物质。按多肽链一级结构不同，趋化因子可分为CXC、CC、C和CX3C等四个亚家族(C为半胱氨酸，X为任意氨基酸)。其中，靠近N端两个半胱氨酸(Cys)之间插有任意一个氨基酸的被称为CXC亚家族，同理，插有任意3个氨基酸的被称为CX3C亚家族。目前CXC家族已发现16个成员，按其结构功能区第一个半胱氨酸前是否存在ELR结构(谷氨酸-亮氨酸-精氨酸，Glu-Leu-Arg)，进一步将其分为ELR+CXC和ELR-CXC两类。目前认为ELR+CXC 类趋化因子(如CXCL1、CXCL3和CXCL5等)可以通过表达于癌上皮细胞上的CXCR2受体而促进其增殖、转移和侵袭，并介导血管发生〔2～4〕。而ELR-CXC 趋化因子如CXCL4、CXCL9和CXCL10则可抑制内皮细胞的趋向性，从而抑制血管发生。有报道〔5〕表明，胰腺癌中CXCL5可通过激活Akt、ERK和STAT等信号通路而介导血管发生，并且CXCL5过表达与胰腺癌的低分化、高分期以及短期存活率密切相关。这与之前研究〔6〕的CXCL5在前列腺癌组织的表达率明显高于前列腺增生组织的结果相一致。本实验结果可见，与其他恶性肿瘤的研究结果相似，外源性重组CXCL5可促进前列腺癌细胞LNCaP的生长。之所以选择LNCaP做生长实验，这是因为相对于其他两株前列腺癌细胞(PC-3和DU145)，CXCR2在LNCaP细胞株的表达量相对较多，因此，外源性CXCL5对其作用可能会更加明显。实验结果也印证了先前提出的假设，即癌间质表达的CXCL5以及癌上表达的CXCL5可分别通过旁分泌和自分泌作用于癌上皮的CXCR2受体而参与前列腺癌的发展与演进过程〔6〕；为进一步建立过表达CXCL5的前列腺间质细胞和癌上皮细胞细胞株，开展CXCL5旁分泌和自分泌机制研究奠定了坚实基础。

4 参考文献

1Balkwill F.Cancer and the chemokine network〔J〕.Nat Rev Cancer,2004; 4(7):540-50.

2Kakinuma T,Hwang ST.Chemokines,chemokine receptors,and cancer metastasis〔J〕 .J Leukoc Biol,2006;79(4):639-51.

3Ben-Baruch A.The multifaceted roles of chemokines in malignancy〔J〕.Cancer Metastasis Rev,2006;25(3):357-71.

4Okabe H,Beppu T,Ueda M,etal.Identification of CXCL5/ENA-78 as a factor involved in the interaction between cholangiocarcinoma cells and cancer-associated fibroblasts〔J〕.Int J Cancer,2012;131(10):2234-41.

5Li A,King J,Moro A,etal.Overexpression of CXCL5 is associated with poor survival in patients with pancreatic cancer〔J〕.Am J Pathol,2011; 178(3):1340-9.

6王伟群,孟德欣,齐亚灵,等.趋化因子CXCL5在前列腺癌组织表达的研究〔J〕.生殖与避孕,2012; 32(7):449-51.