细胞凋亡和细胞自噬在慢性环孢素A肾毒性中的作用

罗 康 朴尚国 金英顺 邹洪斌 苗里宁 金 华 李 灿

(延边大学附属医院肾内科，吉林 延吉 133000)

慢性环孢素 A (CsA) 肾毒性以肾小管间质带状纤维化为特征性病理改变，其分子发病机制不清，可能与炎性介质、局部肾素血管紧张素系统、转化生长因子β1、氧化应激、细胞凋亡等〔1，2〕诸多因素相互作用有关，其中氧化应激扮演着重要角色。长期使用CsA可诱导氧化应激损伤，而氧化应激直接导致肾小管上皮细胞凋亡。与细胞凋亡类似，细胞自噬也将导致大量的肾实质细胞死亡从而形成硬化和纤维化。最近研究〔3,4〕表明，细胞自噬参与了多种肾脏病的发病，如糖尿病肾病、单侧输尿管梗阻模型，而且细胞自噬与氧化应激紧密相关。本研究拟利用慢性CsA肾毒性大鼠模型揭示细胞凋亡和细胞自噬在肾小管间质纤维化(TIF)中的作用。

1 材料和方法

1.1动物模型 雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Technology, 韩国), 体重220～230 g, 喂食低盐饲料1 w后(0.05% sodium, Teklad Premier, Madison, WI, 美国) 随机分成两组：对照组(vehicle,VH,n=8)：皮下注射橄榄油 (1 ml·kg-1·d-1, Sigma，美国) 4 w；CsA毒性组(n=8) 皮下注射CsA(15 mg·kg-1·d-1, Novartis Pharma, Basel, 瑞士) 4 w。

1.2基本测定 每日给药时测定大鼠的体重并记录。4 w后处死大鼠前，将大鼠放入代谢笼中(Tecniplast Gazzada S. a r.l., 意大利)，留取尿液，眼眶取静脉血，利用全自动生化分析仪(Coulter-STKS, Coulter Electronics, 美国)测定血清肌酐和血尿素氮。血CsA浓度是用单克隆抗体放射免疫分析法(Monoclonal Radioimmunoassay, Incstar, Stillwater, MN)测定。

1.3肾脏病理 处死大鼠时留取肾组织，由过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛液固定, 石蜡包埋后切片厚4 μm。脱蜡后行三色染色。TIF程度在每张切片上至少观察20个非重叠区域，用数字化显微镜分析仪(TDI Scope EyeTMVersion 3.0 for Windows, Olympus, 日本)，在100倍显微镜下，每张切片上至少观察非重叠20个不同区域，获取图像，利用 Polygon Program定量计算肾皮质受损部位的百分比(%/0.5 mm2)。由两个观察者对每个样本随机进行盲法评分，取平均值。

1.4细胞凋亡的检测 石蜡包埋切片置二甲苯脱蜡和梯度酒精中脱水后，按 In Situ Apoptosis 测定试剂盒说明步骤，检测细胞凋亡。每张切片上至少观察20个非重叠区域，数字化显微镜分析仪(TDI Scope EyeTMVersion 3.0 for Windows, Olympus, 日本)对原位末端标记法(TUNEL)阳性细胞进行计数，取平均值。

1.5ELISA法检测血、尿8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG) 留取的血、尿样在4℃，转速为12 000 r/min，离心半径为8.84 cm的离心机下离心5 min，取上清液，根据ELISA试剂盒(Shizuoka，日本)步骤检测。

1.6免疫印迹法 提取的肾组织用蛋白质溶解缓冲液(10 mmol/L Tri-Cl, pH7.6; 150 mmol/L NaCl; 1% Sodium deoxycholate; 1% Triton X 100; 0.1% Sodium dodecyl sulfate; 1% aprotinin; 2 mmol/L Na3VO4; 1 μg/ml leupeptin; 1 mmol/L PMSF) 制成匀浆; 4℃下离心(1 500 r/min) 后, 取上清液测定蛋白浓度 (Bio-Rad, Hercules); 20 g 标本在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE); 电转膜 (90 V) 2 h后, 4℃下置Bcl-2抗体于非脂牛乳中以1∶1 000 浓度孵育12～16 h; 室温下缓冲液液洗3次,加辣根过氧化物酶标记的驴抗兔IgG (Amersham) 1 h; 室温下缓冲液液洗3次,增强发光 (ECL, Amersham) 和曝光。 Bax、Caspase-3、自噬相关蛋白(LC3-Ⅱ)的免疫印迹步骤与Bcl-2类似。以对照组为标准 (100%) 测定条带的光密度，用β-actin校正。

2 结 果

2.1建立慢性CsA肾毒性 与对照组(307±3.0)相比，慢性CsA毒性组大鼠(264±4.6)表现为体重下降、血CsA浓度增高(0±0 vs 2 670±317.9)、肾功能低下(血肌酐：38.5±3.9 vs 78.5±14.8，赕酸氮12.5±0.8 vs 27.9±38)，表明成功建立了慢性CsA肾毒性的大鼠模型。

2.2CsA对肾脏病理的影响 与对照组(图1A、图1C)相比，CsA毒性组(图1B、图1D)表现为明显的带状纤维化形成〔(43±9)% vs (0±0)%,P<0.01〕。

图1 两组间肾小管间质纤维化程度和细胞凋亡数

2.3CsA诱导细胞凋亡 TUNEL染色示CsA毒性组大鼠肾小管上皮细胞TUNEL阳性细胞数明显增加(38±6.5 vs 8±3.7,P<0.01)。在分子水平上，CsA致凋亡基因Bax〔(145±17)% vs (100±7)%,P<0.01〕和活化Caspase-3〔(136±13)% vs (100±5)%,P<0.01〕蛋白的表达上调，而抗凋亡基因Bcl2〔(67±9)% vs (100±6)%,P<0.01〕蛋白的表达显著下调，使Bcl-2/Bax比率减少〔(46±19)% vs (100±6)%,P<0.01〕。

2.4CsA诱导细胞自噬 CsA肾毒性组肾中LC3-Ⅱ蛋白的表达明显增加〔(148±12)% vs (100±11)%,P<0.01〕。

2.5CsA诱导氧化应激损伤 与对照组相比，CsA毒性组血〔(223±15)% vs (116±6),P<0.01〕 和尿〔(138±12)% vs (71±7)%,P<0.01〕 氧化应激标志物8-OHdG的水平显著升高。

2.6相关关系 Pearson直线相关分析表明，肾小管间质纤维化程度与TUNEL阳性细胞数和LC3-Ⅱ蛋白表达呈正相关(r=0.759,0.729,均P=0.001)。

3 讨 论

尽管新的免疫抑制剂不断问世，钙调素抑制剂环孢素A(CsA)和他克莫司(FK506)仍为第一线强有力的免疫抑制剂，广泛应用于肾移植、难治性肾病综合征、各种继发性肾小球肾炎、促红素抗体诱导的纯红细胞再生障碍性贫血。因此，揭示慢性CsA肾毒性的发病和防治机制显得尤为重要。本实验利用慢性CsA肾毒性大鼠模型，观察细胞凋亡和细胞自噬是否参与 CsA诱导的肾小管间质纤维化。结果表明，细胞凋亡和细胞自噬是慢性CsA肾毒性的重要发病机制之一。

细胞凋亡在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统器官的发育中起着重要作用。正常生理情况下，细胞凋亡可以清除老化细胞对机体是有益的。然而在病理状态下，细胞凋亡参与多种疾病的发生、发展。研究〔4～7〕表明，细胞凋亡参与了5/6肾切除模型〔5〕、单侧输尿管结扎模型〔4〕、缺血再灌注损伤〔6〕、糖尿病肾病〔7〕等各种肾脏疾病的发病过程。Ortiz等〔8〕报道CsA可直接诱导小鼠肾近曲小管上皮细胞株(MCT)细胞凋亡，呈剂量和时间依赖性。另外，CsA还可通过各种因子如血管紧张素Ⅱ、转化生长因子β1、表皮生长因子等间接地引起肾实质细胞凋亡〔9〕。以往报道过CsA可调控凋亡基因Caspase家族成员和Bcl-2/Bax系统，从而诱导肾小管上皮细胞凋亡，而且细胞凋亡与TIF呈正相关，表明细胞凋亡是引起TIF的发病机制之一〔10〕。基于以上理论，本研究检测了细胞凋亡相关基因，结果表明慢性CsA肾毒性大鼠TUNEL阳性细胞数显著增加，伴随Bcl-2/Bax蛋白表达的比率减少和Caspase-3表达上调，而且TUNEL阳性细胞数和TIF程度呈正相关。因此，推测CsA调控Bcl-2/Bax和Caspase-3导致肾小管上皮细胞凋亡，参与了慢性CsA肾毒性的TIF。

细胞自噬是真核细胞内物质进行周转、维持内环境稳定的重要过程，该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体中进行降解。在新陈代谢、基因毒性、缺血、缺氧等条件下，细胞自噬可作为保护性机制。然而，过度的细胞自噬将导致大量的肾实质细胞死亡从而参与肾损伤过程〔4,11〕。细胞自噬主要有三种形式，即微自噬、巨自噬和分子伴侣介导的自噬。利用电子显微镜和免疫印迹等方法检测细胞自噬。为揭示是否细胞自噬与CsA所致肾脏损伤有关，本实验利用免疫印迹法检测自噬体LC3-Ⅱ蛋白的表达。本研究结果与以往报道相一致，表明在慢性CsA肾脏损伤中，细胞自噬作为重要的发病机制参与了慢性CsA肾毒性的TIF。

氧化应激诱导是肾小管上皮细胞凋亡和细胞自噬参与各种肾脏损伤的过程〔12〕。在慢性CsA肾毒性诸多发病因素中，氧化应激扮演着至关重要的作用。CsA可以直接导致肾入球动脉狭窄引起缺血、缺氧损伤，其结果是产生活性氧自由基和减少抗氧化酶如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶从而诱导氧化应激损伤，而后者反过来引起肾小管细胞凋亡〔13〕。最近报道CsA诱导的氧化应激与细胞自噬紧密相关，因此抗氧化剂如左卡尼汀〔2〕或N-乙酰半胱氨酸〔13〕可明显减少细胞凋亡和细胞自噬。本研究结果表明，长期CsA治疗可导致氧化应激损伤，氧化应激诱发肾小管上皮细胞凋亡和细胞自噬，是慢性CsA肾毒性TIF的重要原因之一。

综上, 细胞凋亡和细胞自噬参与了慢性CsA肾毒性的发病；氧化应激是导致细胞凋亡和细胞自噬的重要因素。本研究结果为临床上进一步认识慢性CsA肾毒性的发病机制提供了分子理论基础。

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