清心开窍方含药脑脊液对氯化钾所致PC12细胞损伤的保护机制

张晓艳 胡海燕 陈 翔 王文花

(温州医科大学第二临床学院，浙江 温州 325003)

清心开窍方用于治疗阿尔茨海默病(AD)疗效显著，尤其对早期出现症状者效果更佳，临床治疗AD能明显改善患者的认知功能障碍、行为和精神症状等〔1～3〕。前期的实验研究证实该方水煎剂能明显改善AD小鼠学习记忆能力，降低AD小鼠脑组织中一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)含量及乙酰胆碱酯酶(AchE)活性，降低氧自由基对机体的损伤，对海马神经细胞具有保护作用〔4～7〕。本研究从细胞水平探讨清心开窍方含药脑脊液对氯化钾损伤所致神经细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1动物及细胞株 SD大鼠60只，雄性，SPF级，体重(250±20)g，健康状况良好，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。许可证号：SCXK(湘)2009-0004。PC12细胞株购自中南大学细胞生物学实验中心。

1.2药材与试剂 清心开窍方(生地、麦冬、白芍、石斛、丹皮、茯神、苦参6 g、陈皮4 g、知母5 g、石菖蒲6 g)：湖南中医药大学附属第一医院药剂科提供。氯化钾：国药集团化学试剂有限公司生产。尼莫地平：山东新华制药有限公司生产，批号：20100711。髙糖DMEM培养基：美国Hyclone公司提供。胎牛血清：Gibco公司提供。胰蛋白酶：上海生工提供。二甲基亚砜：国药集团化学试剂有限公司提供。MTT：美国Sigma公司提供。一步法RT-PCR试剂盒：宝生物工程有限公司提供。Trizol：国药集团化学试剂有限公司提供。100 bp标准DNA分子：美国Promega公司提供。焦碳酸二乙酯(DEPC)：国药集团化学试剂有限公司提供。引物：上海生工生物工程公司合成。

1.3实验用主要仪器 二氧化碳培养箱：日本三洋公司产品。倒置显微镜COVER-018：日本Olympus公司产品。WZ-ZA微量振荡器：北京海淀电子医疗仪器厂产品。TGL16M台式高速离心机：长沙英泰仪器有限公司产品。XW-80A旋涡混合器：上海医科大学仪器厂产品。电热恒温水浴箱(DZ-84)：上海跃进医疗器械厂产品。净化工作台：苏州净化仪器厂产品。酶标仪、紫外分光光度仪、DNA热循环扩增仪：美国Thermo公司产品。超低温冰箱：青岛海尔公司产品。凝胶扫描成像分析系统：美国Startganee公司产品。

1.4含药脑脊液的制备 SD大鼠20只，雄性，给药组10只，灌胃给予清开方水煎液(7.9 g/kg)，2次/d，连续3.5 d。空白组为正常对照组，给予同体积(10 ml/kg)的生理盐水。第7次给药后1 h，以水合氯醛(350 mg/kg)麻醉大鼠，颈后部备皮，75%酒精消毒，将大鼠颈部弯曲以暴露枕骨大孔，用1 ml无菌注射器，从枕骨大孔刺入延髓池，取50 μl脑脊液后迅速抽出针头，合并脑脊液，4 ℃条件离心(3 000 r/min，10 min)，收集上清，过滤，-20 ℃冻存备用。

1.5PC12细胞培养与分组 将复苏后的PC12细胞接种于75 ml培养瓶，用含15%，53℃灭活胎牛血清的高糖DMEM培养基(内含100 U/L青霉素、100 U/L链霉素)，37℃、饱和湿度、5% CO2的培养箱中培养。细胞呈单层贴壁生长，加入0.25%胰蛋白酶消化，调整细胞浓度为0.5×106/ml，接种于涂有多聚赖氨酸的96孔培养板，置于37℃、5% CO2下继续培养24 h，细胞进入对数生长期后开始加药。取长满单层PC12细胞的96孔培养板，弃去培养液，用D-Hank液洗涤2次，加入无血清DMEM，细胞分为①正常组、②模型组、③尼莫地平组、④10%正常脑脊液组、⑤10%含药脑脊液组、⑥20%正常脑脊液组、⑦20%含药脑脊液组，4孔/组。①组加入无血清的DMEM，②～⑦组每孔加入终浓度800 mmol/L的氯化钾造模，37℃、5%CO2培养箱继续孵育24 h，然后③组加入终浓度为1×107mol/L尼莫地平，④组、⑥组分别加入10%、20%正常脑脊液，⑤组和⑦组分别加入10%、20%的清开方含药脑脊液。37 ℃、5% CO2培养箱作用4 h后，弃去培养液，用D-Hank液洗涤2次，加入无血清DMEM培养24 h，在造模过程中及造模后，③～⑦组均加入相应浓度的药物及脑脊液。

1.6MTT检测 称取MTT 0.5 g，溶于100 ml PBS中使其浓度为5 mg/ml，用0.22 μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存。将贴壁率约为80%的PC12细胞用吸管轻轻吹打调成细胞悬液，移至离心管500 r/min，离心5 min，弃上清，加入3 ml完全培养基重复洗一遍，加入完全培养基用吸管轻轻吹打调节PC12细胞密度约0.5×106/ml，接种于96孔培养板，每孔100 μl，置37 ℃，5% CO2细胞培养箱培养24 h。加入不同的造模药物与相应浓度的脑脊液，培养24 h。每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择570 nm波长，在酶标仪上测定各孔OD值并记录。含药脑脊液对PC12细胞的保护率=(含药脑脊液组OD570-空白脑脊液组OD570)/(正常组OD570-模型组OD570)×100%。

1.7RT-PCR检测方法

1.7.1组织中总RNA的提取 取50 mg左右冻存组织标本至匀浆器中加1 ml Trizol快速研磨。将匀浆液转移到无菌、RNasse-free的1.5 ml离心管中，用吸头反复吹打，振荡后室温静置5 min。加人200 μl氯仿，振荡混匀15 s，室温静置3 min，4℃，12 000 r/min离心15 min。将上清小心转移到无菌、RNasse-free的1.5 ml离心管中，加入等体积预冷的异丙醇(-20℃预冷)，混匀，冰浴10 min。4℃，12 000 r/min离心15 min。弃上清，吸水纸控干液体，加人1 ml 75%冰乙醇DEPC水配制)，混匀。4 ℃，8 000 r/min离心5 min，弃上清，吸水纸控干。重复一次。控干后，斜放室温晾20 min，加人20～30 μl DEPC水，所得溶液即为RNA样品，可立即使用或置-80℃冰箱保存。

1.7.2RNA的鉴定 ①RNA纯度鉴定：取5 μl RNA溶液，加DEPC水稀释至60 μl，以DEPC水作为空白对照，读取紫外分光光度计260、280 nm波长下的光密度值，计算其A260/A280的比值。②RNA浓度测定：取5 μl RNA溶液，加DEPC水稀释至60 μl，枪头混匀，以DEPC水作为空白对照，读取紫外分光光度计260 nm波长下的光密度值。③RNA完整性鉴定：应用1%甲醛变性的琼脂糖电泳鉴定RNA完整性。④一步法RT-PCR扩增：参照一步法RT-PCR试剂盒说明进行操作。Bax(扩增片段376 bp)：上游:5'- TGGTTGCCCTTTTCTACTTTG -3'下游:5'- GAAGTAGGAAAGGAGGCCATC -3'；BCl-2(扩增片段236 bp)：上游:5'- GCATCTTCTCCTTCCAG -3'下游:5'- ATCCCAGCCTCCGTTAT -3'；半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3(扩增片段420 bp)：上游:5'-GGTATTGAGACAGACAGTGG -3'下游:5'-CATGGGATCTGTTTCTTTGC-3'；内参β-actin(扩增片段512 bp)：上游:5'-GCCAACCGTGAAAAGATG-3'下游:5'-CCAGGATAGAGCCACCAAT-3'。

1.7.3RT-PCR产物的检测及半定量分析 取6 μl扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，恒压80 V，电泳1 h，紫外灯下分析PCR结果，并用凝胶成像分析系统测定灰度值，计算Bcl-2，Bax,Caspase-3/β-actin的比值，以获得目的片段的相对表达量。

2 结 果

2.1PC12细胞活力比较 与正常组相比，模型组OD值明显降低(P<0.01)；与模型组相比，10%、20%正常脑脊液组OD值无显著性差异(P>0.05)；尼莫地平组、10%、20%含药脑脊液组OD值均明显升高(P<0.01)；与尼莫地平组相比，10%、20%含药脑脊液组OD值均无显著性差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组PC12细胞活力比较

2.2PC12细胞Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、Caspase-3、mRNA表达水平比较 与正常组相比，模型组Bax mRNA、Caspase mRNA表达明显升高，Bcl-2 mRNA明显降低(P<0.01)；与模型组相比，10%、20%正常脑脊液组Bax mRNA表达无显著性差异(P>0.05)；尼莫地平组、10%、20%含药脑脊液组Bax mRNA、Caspase-3 mRNA表达均明显降低(P<0.01)；与尼莫地平组相比，10%、20%含药脑脊液组Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、Caspase-3 mRNA表达无显著性差异(P>0.05)。见图1，表2。

M：Marker；1：正常组；2：模型组；3：尼莫地平组；4：10%正常脑脊液组；5：10%含药脑脊液组；6：20%正常脑脊液组；7：20%含药脑脊液组

表2 PC12细胞Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、Caspase-3 mRNA表达水平比较

3 讨 论

AD其首要症状是智力、记忆力、感官定向力、判断力、语言思维能力不可逆的进行性退化，并常伴有性格改变。PC12 细胞为大鼠肾上腺嗜铬肿瘤细胞株，具有较典型的神经内分泌细胞特性，可传代，已广泛用作神经细胞体外模型。MTT 测试通过测定细胞线粒体脱氢酶活性借以判断活细胞数目，即OD值。OD值越大，表示存活的细胞数目越多，细胞损伤越小。

凋亡参与了AD神经元的变性，它是由多基因控制的细胞主动死亡的过程，受促凋亡和抑凋亡基因的协同控制。目前已知有多种基因，如Bcl-2、Bax、P53、fas等〔8〕，特别是Bax和Bcl-2基因与凋亡的调控关系更为密切〔9，10〕。Bcl-2和Bax作为一对关系密切的凋亡相关基因，在中枢神经系统中均有表达，在神经细胞凋亡的控制中起重要作用。Bcl-2基因有促进细胞周期和细胞增殖的能力，其过度表达可特异性抑制细胞凋亡，Bax基因的过度表达能加速IL-3细胞株在细胞因子缺失时发生细胞凋亡，并对抗Bcl-2对细胞凋亡的抑制作用，从而促进细胞凋亡〔11〕。一般认为Bcl-2主要在凋亡上游事件中起保护作用，而Caspase-3主要在凋亡的下游事件中发挥促凋亡作用。最新研究证实了Caspase介导的APP切割产物与Aβ共定位于AD老年斑中。可见Caspase在调节神经毒性Aβ的生成及在AD神经元最终的凋亡中有着极其重要的作用〔12〕。

本研究说明含药脑脊液对KCL 诱导的PC12 细胞凋亡的保护作用通过在转录及翻译水平调节Bcl-2 和Bax 的表达实现,也证明了清心开窍方对PC12 细胞线粒体通路的凋亡具有抑制作用，这可能是该方抗老年性痴呆的机制之一。

4 参考文献

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