Runx3和C-myc基因在结直肠癌组织中的表达及临床意义

郑 玮 邹兆伟 钟 林 黄宗海

(南方医科大学珠江医院，广东 广州 510280)

近年研究发现，癌基因和抑癌基因的表达失调与结直肠癌的发生密切相关。Runx3抑癌基因是转化生长因子(TGF-β)转导通路中的关键因子, 参与TGF-β通路对上皮细胞的负性调控, 并与细胞分化、细胞周期调控、细胞凋亡和恶性转化有关，主要机制为启动子区甲基化以及杂合性缺失。原癌基因myc(v-myc)最初发现于鸡的逆转录病毒中，其在哺乳动物中的同源对应物为C-myc基因。C-myc基因与细胞生长分裂密切相关, 能调控细胞增殖、分化, 而其过度表达可诱导细胞转化与肿瘤形成〔1〕,参与肿瘤的发生。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2012年5～12月南方医科大学珠江医院普通外科结直肠癌手术标本63例，手术切除结直肠标本后，癌组织取自肿瘤中心部位(非坏死部位)，另取肠管近端切缘(距肿瘤处≥5 cm，且经病理确认为正常组织)。作为对照组的癌旁正常组织，立即放入液氮中冷冻保存备用,手术标本术后送病理，明确诊断为癌。63例患者中男34例，女29例，年龄30～87岁，中位年龄61岁，结肠30例，直肠33例；腺癌53例，黏液癌10例；分化程度：高分化5例，中分化52例，低分化6例。Dukes分期：A期12例，B期24例，C期26例，D期1例；淋巴结转移25例，无淋巴结转移38例。所有患者术前均未接受化疗、放疗及其他抗癌治疗。

1.2Western印迹检测Runx3与C-myc的表达 将约100 mg组织样品用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，用剪刀将组织剪成小块，放入组织匀浆器中，与配置好的1 ml裂解液(购自凯基全蛋白提取试剂盒)充分混匀，上下匀浆15次。将匀浆后的组织及裂解液4℃离心30 min。将上清转移至离心管中，取上清10 μl进行蛋白定量。蛋白定量后，取30 μg总蛋白经10%+二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳分离，并通过恒压转印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脱脂奶粉封闭3 h，Tris盐酸缓冲液(TBST)洗膜2 次，每次5 min。用抗-Runx3 抗体(1∶1 000 稀释)，抗-C-myc 抗体(1∶1 000 稀释),内参抗-GAPDH抗体(1∶1 000稀释)4℃孵育过夜。TBST 洗膜4次，每次5 min。再用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(1∶4 000 稀释)孵育1 h，TBST洗膜4次，每次5 min。增强化学发光法(ECL)显色，压片，Quantity One灰度软件分析，得出目的基因灰度值。

图1 Runx3在各期各分化程度的表达

图2 C-myc在各期各分化程度中的表达

2 结 果

Runx3蛋白在结直肠癌组织中的表达(1.075 3±0.492 8)较癌旁组织(2.070 1±1.002 5)下调，C-myc蛋白在结直肠癌组织中的表达(2.240 6±0.607 1)较癌旁组织上调(1.372 9±0.472 9)(P=0.000，P=0.000)。其各自的表达在不同Dukes分期、浸润深度、淋巴结转移状态及病理分化类型差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1，图2。Runx3表达与患者性别、年龄、肿瘤病灶部位无相关性，与组织类型、肿瘤腔内直径有相关性(P<0.05)；C-myc与患者性别、年龄、组织类型，肿瘤腔内直径无相关性，可能与肿瘤病灶部位有相关性(P<0.05)。线性相关分析，二者的表达呈负相关(r=-0.398，P=0.001)。见表1。

表1 结直肠癌Runx3和C-myc蛋白表达与结直肠癌不同临床病理参数的关系

3 讨 论

Runx3为抑癌基因，Runx3启动子区域的CpG岛的甲基化是导致Runx3表达下调的重要原因,其活性同时可能也受到多种信号通路的影响，如磷酸化、乙酰化和泛素化降解等。Runx3抑癌机制与具有诱导生长抑制、凋亡功能的TGF-β通路密切相关〔2，3〕。研究表明〔4〕，Runx3可能是TGF-β信号传导通路的关键作用靶点。在TGF-β信号传导过程中，TGF-β与Smad形成的复合物需在Runx3蛋白的介导下完成由胞质转入胞核内的过程，并可增强其与核内特异性靶点的结合力，共同调节相关靶基因的转录。Runx3表达沉默可导致TGF-β信号途径紊乱，引起TGF-β信号失活，进而引发细胞凋亡障碍，导致肿瘤的发生。Kim等〔5〕研究结果表明，大肠癌中Runx3的表达量明显低于正常黏膜组织，Runx3基因表达缺失与大肠癌分期有关，Runx3表达在低分化和伴有淋巴结转移组中明显低于中高分化和未转移组。本实验结果与此相符。

既然TGF-β/Smad信号通路参与了结直肠癌的发生和发展〔6〕，而Runx3蛋白是Smad信号途径的主要靶蛋白之一〔4〕，它也应该与这些生物学行为的调节过程有关。Runx3蛋白可能通过几个方面促成癌症的诱导，包括细胞周期调控失调、细胞凋亡失效、细胞异常分化和血管生成异常等。

C-myc癌基因具有双向调节作用, 既可介导细胞增殖, 又可介导细胞凋亡, 其调节方向取决于细胞接收的信号或细胞所处的生长环境。既往研究表明C-myc可激活细胞的端粒酶, 诱导细胞端粒酶的转录，使细胞“永生化”，从而诱导肿瘤的形成。Knies-Bamforth等〔7〕报道C-myc可促进血管内皮生长因子的表达, 促进新生血管形成，为肿瘤形成提供条件。已证实 C-myc在结直肠癌的发生中起癌基因作用〔8,9〕，陆毅〔10〕还发现C-myc基因在结肠癌组织中高度表达，癌旁正常组织中的表达明显下降；C-myc基因的表达与结肠癌浸润深度、淋巴结转移、肿瘤分期密切相关，与年龄、性别、肿瘤大小、组织学类型和分化程度无关，提示C-myc基因的表达增强与结肠癌的发生发展有着密切关系。本研究结果也进一步证实了这一点。

骨形态发生蛋白(BMPs)是TGF-β超家族的成员，是一种多功能细胞因子，调节广泛的生物学功能。Runx3是TGF-β和BMP介导的信号转导通路的一部分。此通路提出了两个平行途径，一种为直接通过绑定Runx3、C-myc基因启动子的结合位点，抑制C-myc的表达。C-myc基因启动子的转录活性被BMP与Runx3复合物下调。另一种是通过BMP和Runx3基因转录，抑制β-catenin/TGF4的信号活动。BMP可抑制β-catenin，影响C-myc基因启动子，从而影响C-myc基因的转录，此部分是β-连环素/T-细胞转录因子(β-catenin/TGF4)介导的过程。Lee等〔11〕通过研究BMP信号通路的分子基础，检测经BMP预处理的人类大肠癌细胞株HT-29的Runx3、C-myc mRNA和蛋白表达以及HT-29细胞凋亡率,证实BMP信号通路通过上调Runx3降低C-myc表达。本研究提示Runx3蛋白在结直肠癌组织中表达下调，C-myc蛋白在结直肠癌组织中表达上调，二者的表达呈负相关。但由于实验条件所限，具体分子机制与作用靶点有待下一步研究。

4 参考文献

1He C, Hu H, Braren R,etal.c-myc in the hematopoietic lineage is crucial for its angiogenic function in the mouse embryo〔J〕.Development,2008;135(14): 2467-77.

2Tan SH, Ida H, Lau QC,etal.Detection of promoter hypermethylation in serum samples of cancer patients by methylation-specific polymerase chain reaction for tumour suppressor genes including RUNX3〔J〕.Oncol Rep,2007;18(5): 1225-30.

3Smith E, De Young NJ, Pavey SJ,etal.Similarity of aberrant DNA methylation in Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma〔J〕.Mol Cancer,2008;7:75.

4Kato N, Tamura G, Fukase M,etal.Hypermethylation of the RUNX3 gene promoter in testicular yolk sac tumor of infants〔J〕.Am J Pathol,2003;163(2): 387-91.

5Kim TY, Lee HJ, Hwang KS,etal.Methylation of RUNX3 in various types of human cancers and premalignant stages of gastric carcinoma〔J〕.Lab Invest,2004;84(4): 479-84.

6Ai X, Wu Y, Zhang W,etal.Targeting ERK pathway reduces liver metastasis of Smad4-inactivated colorectal cancer〔J〕.Cancer Biol Ther,2013;14(11):1059-67.

7Knies-Bamforth UE, Fox SB, Poulsom R,etal.c-Myc interacts with hypoxia to induce angiogenesis in vivo by a vascular endothelial growth factor-dependent mechanism〔J〕. Cancer Res,2004;64(18): 6563-70.

8Chen B, Zhang XY, Zhang YJ,etal.Antisense to cyclin D1 reverses the transformed phenotype of human gastric cancer cells〔J〕.World J Gastroenterol,1999;5(1):18-21.

9Bala S, Peltomäki P.CYCLIN D1 as a genetic modifier in hereditary nonpolyposis colorectal cancer〔J〕.Cancer Res,2001;61(16): 6042-5.

10陆 毅.C-myc基因和P16基因在结肠癌中的表达及其临床意义〔J〕.中国老年学杂志,2010；30(11):1602-3.

11Lee CW, Ito K, Ito Y. Role of RUNX3 in bone morphogenetic protein signaling in colorectal cancer〔J〕.Cancer Res,2010;70(10): 4243-52.