老年肺癌E-cadherin、BNIP3、HIF-1α的表达与临床意义

2014-09-12于学燕

中国老年学杂志 2014年9期

于学燕

(山东省胸科医院肿瘤内科，山东济南 250013)

肺癌患者常因癌肿转移或恶性侵袭而死亡，因此，如何减少肺癌恶性侵袭与癌肿的转移成为临床诊治肺癌的研究热点〔1〕。上皮型E-钙黏蛋白(E-cadherin)在肿瘤的侵袭与转移中起着重要作用〔2〕。Bcl-2/腺病毒E1B19 kD结合蛋白3(BNIP3)则通过促进线粒体水肿，影响肿瘤细胞能量代谢等线粒体途径，从而促进肿瘤组织的凋亡〔3〕。缺氧诱导因子(HIF)-1α可在缺氧的环境中导致葡萄糖转运蛋白1、血管内皮因子、促红细胞生成素与碳酸酐酶9等基因的表达降低〔4〕。本研究利用免疫组化法与RT-PCR检测方法，检测E-cadherin、BNIP3、HIF-1α在老年肺癌组织中的表达与临床意义。

1 资料与方法

1.1材料 75例肺癌组织采集于山东省胸科医院肿瘤内科2010年1月至2013年8月住院患者存取的肺癌组织蜡块，全部患者符合肺癌的临床诊断标准，按世界卫生组织(WHO)老年人划分的新标准〔5〕为>60岁的高龄患者〔6〕。排除标准〔6〕：曾行免疫治疗、化疗与放疗，具有手术禁忌证的患者。男57例，女 18例，其中小细胞癌13例，腺癌25例，支气管肺癌14例，鳞癌23例；无淋巴结转移28例，有淋巴结转移47例；Ⅰ期33例，Ⅱ期32例，Ⅲ期8例，Ⅳ期2例。45例正常肺组织采集于癌旁远处正常肺部组织并存档蜡块；8%～10%甲醛固定，石蜡，苏木精-伊红(HE)染色剂。

1.2试剂免疫组化试剂盒，抗体，磷酸盐缓冲液(PBS)配方，RT-PCR反应体系包括12.5 μl Master Mix(dNTP、DNA Polymerase、缓冲液等试剂混合物)、0.4 μl上游引物、0.4 μl下游引物、10.7 μl去离子水、1 μl 模板；2%琼脂糖凝胶。

1.3检测方法

1.3.1免疫组化方法 (1)E-cadherin蛋白检测：免疫组化试剂盒由Zymed公司提供,1%鼠抗人E-cadherin 抗体均由Zymed公司提供，严格按照试剂盒的操作规范，进行E-cadherin蛋白表达情况的测定；(2)BNIP3蛋白测定：BNIP3兔多克隆抗体由英国Abcam公司提供,切片脱水后进行微波加热修复，放进pH6的缓冲液中，盖上小孔盖子，微波加热直至沸腾，加热修复液10～15 min，室温下冷却30 min后滴加PBS配方，室温下放置20 min，PBS配方再次进行缓慢冲洗3次，约2 min/次，HE染色，树胶固定，阳性切片作为肺癌组，PBS缓冲液配方作为单抗正常肺组织组。(3)2%兔抗人HIF-1α抗体由中国柏世德公司提供，严格按照试剂盒说明进行操作，PBS缓冲液作为阴性正常肺组织组。

1.3.2RT-PCR方法通过RT-PCR方法进行E-cadherin 、BNIP3、HIF-1α mRNA检测，标本速冻后冷存于-80℃中，按照TRIZOL试剂盒说明提取总mRNA，按照FRTS试剂盒说明进行cDNA转录合成操作，按照Primer 6.0设计PCR引物序列，在72℃～95℃中进行RT-PCR反应，常规琼脂凝胶电泳分析，用Kodark 1D成像系统进行凝胶成像扫描，以β-actin作为对照。

1.4观察指标

1.4.1蛋白表达评定根据细胞质或细胞核呈现黄色作为阳性细胞的标准，观察并记录阳性细胞率与显色强度，每张切片在400倍镜中随机采集5个视野，统计阳性细胞与癌肿细胞的比率作为阳性细胞率，按照阳性细胞率的大小进行0～4分的评分。根据染色程度进行显色强度的评分。①阳性细胞率的评分标准：0分(0～5%)、1分(6%～25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)、4分(76%～100%)；②显色强度评分标准：0分(染色与阴性组相同)、1分(淡黄色)、2分(接近深褐色)、3分(深褐色)。阳性细胞率与染色强度乘积作为免疫组化评分，评分在3分以上为阳性病例；由两名病理医生进行蛋白表达的评定。

1.4.2E-cadherin、BNIP3、HIF-1α蛋白表达相关性评价根据高表达和低表达的分类标准〔5〕：免疫组化经两名病理医生看过后均评为8分及其以上为高表达，评分在3～7分为低表达。

1.5统计学方法应用SPSS17.0软件进行分析，计量资料采用t检验，计数资料组间比较采用χ2检验，相关分析采用Spearman检验。

2 结果

2.1E-cadherin、BNIP3、HIF-1α蛋白表达肺癌组E-cadherin阳性表达率(62.67%，47例)显著低于正常肺组织组(100.00%，45例)；肺癌组BNIP3、 HIF-1α阳性表达率(68.00%，51例；53.33%，40例)显著高于正常肺组织组(均为6.67%，5例)(均P<0.05)。

2.2E-cadherin、BNIP3、HIF-1α mRNA表达肺癌组织E-cadherin密度比值(1.51±0.38)显著低于正常肺组织(3.16±0.51)，肺癌组织BNIP3、HIF-1α密度比值(1.48±0.37，1.19±0.29)显著高于正常肺组织(0.21±0.04，0.22±0.05)(P<0.05)。见图1。

A:肺癌组织;B:正常组织

2.3E-cadherin、BNIP3、HIF-1α蛋白表达的相关性 E-cadherin和BNIP3表达阳性率在肺癌组织中呈负相关(r=-0.37,P<0.05)；E-cadherin阳性率在肺癌组织中蛋白阳性表达率中呈负相关(r=-0.39,P<0.05)；BNIP3与HIF-1α表达阳性率在肺癌组织中阳性率呈正相关(r=0.41，P<0.05)。见表1。

表1 E-cadherin、BNIP3、HIF-1α蛋白表达的相关性(n)

2.4E-cadherin、BNIP3、HIF-1α表达与临床病理特征的关系 E-cadherin的表达与肺癌的分化程度、临床分期、淋巴转移与组织学类型相关，主要表现为高分化、Ⅰ～Ⅱ型、无淋巴结转移与支气管肺癌的阳性表达率越高；BNIP3的表达与肺癌的分化程度、临床分期、淋巴转移与组织学类型等临床病理因素均无关系；HIF-1α其中阳性与分化程度、临床分期与组织学类型相关，主要表现为低分化、Ⅲ～Ⅳ期、鳞癌的HIF-1α的阳性表达率越高。见表2。

表2 E-cadherin、BNIP3、HIF-1α表达阳性率与临床病理特征的关系〔n(%)〕

3 讨论

目前，肺癌的发生和转移机制尚未完全明确，以致肺癌的临床疗效及预后均不理想。尤其对于老年患者来说，相关研究更为少见；肿瘤的侵袭与转移是影响肺癌临床疗效及预后的重要因素之一〔7〕。在对其他肿瘤的研究中发现肿瘤可形成间质性的浸润，造成细胞黏附力的减弱，恶性肿瘤细胞通过血管与淋巴结进行全身各器官的转移。E-cadherin是细胞黏附分子家族的成员，研究〔8〕表明，E-cadherin表达下降可造成细胞与细胞之间的黏附力下降，加速恶性肿瘤的转移速度。BNIP3则是能与Bcl-2、E1B19k相结合的蛋白，定位与线粒体上，HIF-1α可使BNIP3呈现高表达，两者共同作用下可使缺氧环境下的靶基因呈现更高表达。BNIP3的过表达可降低线粒体的功能导致正常细胞的死亡〔9〕；研究〔10〕表明，BNIP3通过降低抗凋亡蛋白的作用并以游离的状态下自身激活增加线粒体的通透性，增加诱导凋亡因子的释放造成正常细胞的死亡。多种研究〔11〕表明，BNIP3与HIF-1α的表达呈正相关，并在各种恶性肿瘤组织中呈现高表达。肿瘤组织必须抵抗缺氧微环境下不利于生存的环境，适应缺氧环境后可诱导新生血管的产生〔12〕，HIF-1α在缺氧环境下可存在一种转录因子，检测肿瘤组织的HIF-1α可预测肿瘤微环境下的缺氧情况，另外，HIF-1α具有对各种血细胞生成素表达的调控作用，在恶性肿瘤的增殖、转移与癌肿的血液支持中起着重要的作用，研究〔13〕证明：多种癌症组织中均存在HIF-1α的高表达情况，可预测HIF-1α的表达与癌症患者的预后关系密切。

E-cadherin、HIF-1α表达均与组织学类型、临床分期等临床病理因素密切相关，在肺癌组织中，E-cadherin呈低表达，BNIP3与HIF-1α呈高表达，E-cadherin与BNIP3、HIF-1α呈负相关，BNIP3与HIF-1α呈正相关，E-cadherin、BNIP3、HIF-1α的检测均在诊治与预测肺癌病情的严重程度中具有重要的临床意义，而其相关机制仍需进一步探讨。

4 参考文献

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