胃癌发生、发展和治疗相关microRNAs及其作用靶点的研究进展

郭梦舟 崔越宏 刘天舒

复旦大学附属中山医院肿瘤内科(200032)

MicroRNAs(miRNAs)是一类长约20个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，广泛存在于真核生物中，在进化中具有保守性。MiRNAs参与调节人类约1/3的基因，在细胞生长、分化和凋亡过程中起重要作用，与人体生长、发育和疾病密切相关。近年研究发现miRNAs与肿瘤关系密切，某些miRNAs可发挥类似癌基因或抑癌基因的作用，其表达紊乱或功能异常可导致其靶基因调节异常，从而参与肿瘤发生、发展。胃癌为全球高发的恶性肿瘤，发病率和死亡率分别位居第4位和第2位[1]，目前已发现多种miRNAs及其作用靶点与胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡以及化疗敏感性密切相关。本文就胃癌相关miRNAs及其作用靶点以及靶向miRNAs在胃癌治疗中应用的研究进展作一综述。

一、MiRNAs的生物合成和作用机制

通常编码miRNAs的基因位于已知基因的内含子中，亦有位于基因间区域者。动物体内编码miRNAs的基因首先在RNA聚合酶Ⅱ的作用下形成长约数百个核苷酸的初级转录物pri-miRNAs[2]，后者在细胞核内被RNA酶Ⅲ家族酶Drosha与双链RNA结合蛋白DGCR8组成的多蛋白复合物剪切成长60～70个核苷酸、具有茎环结构的miRNAs前体pre-miRNAs[3]。pre-miRNAs由转运蛋白exportin-5从细胞核运送至细胞质[4]，被另一RNA酶Ⅲ家族酶Dicer剪切成长18～22个核苷酸的双链miRNAs[5-6]，其中一条链结合至miRNA诱导沉默复合物(miRNA-induced silencing complex, miR-ISC)，成为成熟miRNAs，另一条链则被降解。MiR-ISC由反式激活应答(TAR)元件RNA结合蛋白(TRBP)和Argonaute(Ago) 蛋白家族组成[5]，miRNAs通过特异性识别靶mRNA的3’非翻译区(3’ UTR)引导miR-ISC降解靶mRNA或抑制靶mRNA翻译[7]。当miRNAs与靶mRNA的碱基接近完全互补配对时，靶mRNA被降解而失去活性；当miRNAs与靶mRNA不完全互补配对时，靶mRNA的翻译受到抑制。

二、MiRNAs与胃癌的发生、发展

目前应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、RNA印迹法和微阵列分析已发现多种与胃癌细胞生长、转移、凋亡和化疗敏感性相关的miRNAs。在胃癌中异常表达的miRNAs根据其作用可分为两大类：具有致癌作用的miRNAs(oncogenic miRNAs, oncomiRs)和发挥抑癌作用的miRNAs(tumor-sup-pressive miRNAs， ts-miRs)。

1. OncomiRs及其作用靶点：OncomiRs通过下调肿瘤抑制因子或其他相关靶基因达到促进肿瘤细胞生长、转移、抑制肿瘤细胞凋亡或增加遗传不稳定性的效应，从而参与胃癌的发生、发展。

Wang等[8]应用qRT-PCR技术发现，miR-301a在胃癌组织以及9种胃癌细胞株中表达上调，其高表达与胃癌细胞低分化相关，作用靶点为RUNX3。RUNX3可激活促凋亡基因Bim，并下调侵袭蛋白基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达，而miR-301a可分别通过抑制RUNX3/Bim途径和RUNX3/MMP-9途径促进胃癌细胞增殖、侵袭。TNFAIP1基因可诱导细胞凋亡，Zhang等[9]发现miR-373在胃腺癌组织和胃癌细胞株AGS中表达上调，可通过与3’ UTR结合直接抑制靶基因TNFAIP1表达，使其丧失对细胞生长的抑制作用，参与促进胃癌发生。Zhu等[10]证实白细胞介素-6受体(IL-6R)是一种抗增殖蛋白，其表达水平与miR-23a呈负相关，miR-23a可通过直接抑制IL-6R促进胃腺癌细胞株MGC-803生长。此外，金属硫蛋白2A(MT2A)亦为miR-23a的靶基因，miR-23a可通过抑制MT2A促进胃癌细胞生长，对抗细胞凋亡[11]。Zhang等[12]发现miR-21可通过作用于抑癌基因RECK，参与促进胃癌细胞增殖，抑制细胞凋亡。MiR-106a表达水平在多药耐药胃癌细胞株中显著升高，通过抑制其靶基因RUNX3而上调多药耐药相关蛋白1(MRP1)表达，MRP1进而通过加速化疗药物的泵出以及抑制胃癌细胞凋亡对抗包括阿霉素、顺铂、5-氟尿嘧啶在内的化疗药物的作用[13]。

转化生长因子-β1(TGF-β1)信号途径与胃癌的发生、发展和转移密切相关，其通过与TGF-β受体Ⅱ(TGFβ-RⅡ)结合，使磷酸化的Smad3与细胞内信使Smad4结合并易位至细胞核，激活特定靶基因，抑制细胞增殖和转移。Zhang等[14]发现miR-199a可通过抑制Smad4减弱TGF- β1诱导的细胞周期阻滞和促凋亡效应，提高胃癌细胞在琼脂中的锚定非依赖性生长能力。Lo等[15]发现转染miR-370可使胃癌细胞株更具侵袭性，并使裸鼠成瘤模型更易发生腹腔转移。进一步研究其作用机制，发现miR-370系通过抑制TGFβ-RⅡ表达、减弱TGF-β1介导的Smad3磷酸化而诱导胃癌细胞转移。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移、侵袭能力的重要生物学过程。Hsu等[16]应用胃癌细胞株SC-M1和裸鼠成瘤模型对miR-363进行研究，发现其表达在肿瘤细胞中显著上调。进一步的研究发现，miR-363系通过直接抑制抑癌基因c-Myc启动子结合蛋白1(MBP-1)诱导EMT发生并上调原癌基因c-Myc表达，从而促进胃癌细胞生长、转移。分别将SC-M1/HA-MBP-1(MBP-1表达)和SC-M1/pcDNA3(MBP-1不表达)胃癌细胞注入免疫缺陷小鼠尾静脉，发现相对于MBP-1表达组，MBP-1不表达组有数量更多的肺部转移灶，证实miR-363系通过抑制MBP-1而提高胃癌细胞的转移能力。Jin等[17]通过荧光素酶报告基因检测技术发现活化白细胞黏附分子(ALCAM)为miR-215的靶基因，在胃癌细胞中敲除ALCAM或转染miR-215模拟物均可促进细胞转移，表明miR-215系通过下调ALCAM参与胃癌进展。

2. Ts-miRs及其作用靶点：Ts-miRs可通过介导细胞周期阻滞、促进细胞凋亡等途径发挥抗肿瘤作用，其在胃癌中通常表达下调或缺失。

Tang等[18]应用qRT-PCR技术发现miR-200b、miR-200c在胃癌组织以及7种胃癌细胞株中表达下调，其表达水平与肿瘤浸润深度和淋巴结转移呈负相关。进一步研究其作用机制，发现两者可通过与3’ UTR结合而直接抑制DNA甲基转移酶(DNMT)3A、DNMT3B，或通过抑制转录因子SP1间接抑制DNMT1，导致DNA低甲基化，从而使沉默的抑癌基因如p16、RASSF1A以及上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)恢复表达，抑制胃癌细胞增殖、侵袭。Song等[19]发现在胃癌细胞中敲除胆囊收缩素B受体(CCKBR)可抑制细胞增殖，在转染miR-148b的胃癌细胞株和裸鼠成瘤模型中同样可观察到此现象，荧光素酶报告基因检测证实CCKBR为miR-148b的靶基因。在胃癌细胞株和胃癌组织中，miR-212与视网膜母细胞瘤结合蛋白2(RBP2)含量呈负相关，可通过下调RBP2恢复细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂p21CIP1和p27kip1表达，引起细胞周期阻滞而抑制胃癌细胞增殖[20]。Zhang等[21]证实miR-206在体内和体外均可抑制胃癌细胞增殖，而其机制之一为miR-206作用于细胞周期蛋白D2(CCND2)而抑制其表达，诱导细胞周期阻滞于G0/G1期。MiR-29家族(miR-29a、b、c)是另一以CCND2为作用靶点的ts-miRs，可直接作用于CCND2/p-Rb途径，抑制胃癌细胞增殖；同时通过作用于CCND2和MMP-2，降低胃癌细胞的迁移、侵袭能力[22]。DNA甲基化使miR-129在胃癌中呈低表达，上调miR-129能有效抑制胃癌细胞增殖，促进细胞凋亡，该作用与下调CDK6有关[23]。Chang等[24]发现敲除RhoE基因可显著增加耐药胃癌细胞株SGC7901/DDP对顺铂的敏感性，而miR-200c可直接抑制RhoE，提示miR-200c可间接调控胃癌细胞对顺铂的敏感性。

某些miRNAs表达下调可影响胃癌细胞的侵袭、转移能力，进而影响肿瘤临床分期和预后。Gao等[25]发现miR-145的表达水平在正常胃黏膜、胃癌原发灶和转移灶中呈阶梯式下降。神经钙黏蛋白(N-cadherin)是一种受Ca2+调节的细胞黏附分子，与细胞侵袭能力增强有关，该研究显示miR-145可通过与3’ UTR结合直接抑制N-cadherin，减少胃癌细胞的侵袭、转移。UHRF1是一种表观遗传学调控因子，可抑制多种抑癌基因表达。Zhou等[26]证实UHRF1在胃癌组织中表达上调，并与胃癌细胞低分化、淋巴结转移、器官转移和TNM分期密切相关；将miR-146a、miR-146b转染入胃癌细胞株可下调UHRF1，通过去甲基化形式使受UHRF1调控的抑癌基因Slit3、CDH4和RUNX3重新表达，进而抑制胃癌细胞侵袭、转移。细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)参与细胞增殖、分化、凋亡、恶变等多种生物学过程，miR-219-2-3p可通过下调ERK1/2达到抑制胃癌细胞增殖、转移和促进细胞凋亡的作用[27]。在胃癌细胞株MKN45和SGC7901中，miR-146a与WASP家族富含脯氨酸同源蛋白2(WASF2)含量呈负相关，Yao等[28]证实miR-146a可通过靶向WASF2抑制胃癌细胞转移。Deng等[29]发现miR-26a低表达的胃癌患者总生存期、无复发生存期显著短于miR-26a高表达者，该研究证实miR-26a在体内和体外均可抑制胃癌细胞侵袭、转移，碱性成纤维细胞生长因子9(bFGF9)基因为其作用靶点。

上述与胃癌发生、发展相关的miRNAs及其作用靶点总结归纳于表1。

表1 胃癌相关miRNAs及其作用靶点

三、MiRNAs与胃癌的治疗

MiRNAs通过调控靶mRNA参与肿瘤发生、发展，发挥类似癌基因或抑癌基因的作用，相关研究证实其在肿瘤与正常组织中的表达水平存在显著差异。改变miRNAs在肿瘤组织中的表达水平可调控其作用靶点和通路，进而逆转肿瘤细胞的恶性生物学行为，在肿瘤靶向治疗中具有巨大潜能。

针对具有癌基因性质的oncomiRs，可应用反义寡核苷酸、miRNA海绵(miRNA sponge)、锁核酸(locked nucleic acid, LNA)等技术下调其表达。Zhang等[12]应用反义寡核苷酸技术下调原本高表达的miRNA-21，达到了抑制胃癌细胞增殖、促进细胞凋亡的效果。An等[11]发现下调miR-23a在胃癌细胞株BGC823及其裸鼠成瘤模型中的表达，可使肿瘤细胞增殖受抑，肿瘤体积变小，提示抑制miR-23a可能成为治疗胃癌的有效方法。

针对具有抑癌基因性质的ts-miRs，可构建病毒或脂质体载体将miRNAs模拟物转染入相应组织以上调其表达。Tang等[18]将miR-200b、miR-200c模拟物转染入胃癌细胞株MGC-803和AGS，发现细胞增殖、迁移、侵袭能力受到明显抑制。Gong等[22]发现转染miR-29家族高表达模拟物可明显抑制胃癌细胞株HGC-27和MGC-803的生长、转移，裸鼠成瘤实验显示miR-29家族高表达可显著减小肿瘤体积，减轻肿瘤质量。Gao等[25]通过裸鼠成瘤实验发现miR-145表达组小鼠不发生肿瘤转移，而对照组则出现肿瘤侵犯邻近组织和肌肉组织的现象；将miR-145表达胃癌细胞注入小鼠尾静脉，该组小鼠肺部转移灶数量较对照组显著减少，表明miR-145可用于胃癌远处转移的治疗。

胃癌细胞对化疗药物的耐药性是提高胃癌患者生存率和生活质量的一大障碍，研究表明调控某些miRNAs可影响肿瘤细胞的化疗敏感性，从而改变治疗效果。Eto等[30]将miR-21抑制剂转染入人表皮生长因子受体2(HER2)阳性胃癌细胞株NUGC4，发现胃癌细胞对曲妥珠单抗的敏感性显著增加，而转染miR-21模拟物的作用与之相反。该研究证实miR-21抑制剂系通过调控PTEN/AKT途径促进胃癌细胞凋亡，从而提高曲妥珠单抗的疗效。Chen等[31]发现将miR-200c转染入耐药胃癌细胞株SGC7901/DDP可提高其对顺铂、5-氟尿嘧啶、紫杉醇和阿霉素的敏感性，其机制与miR-200c通过E-cadherin途径间接调控细胞凋亡相关基因如Bax、Bcl-2有关。

四、结语

综上所述，miRNAs与相应靶基因组成的错综复杂的调控网络参与了肿瘤的发生、发展，对胃癌相关miRNAs及其作用靶点的探讨将为胃癌发生机制的研究提供新的思路。尽管miRNAs与胃癌的发生、发展和治疗密切相关，但将其转化为临床治疗手段仍存在诸多困难，如如何解决脱靶效应、表达载体的毒性反应以及减少免疫反应等问题。相信随着研究的不断深入，针对miRNAs的靶向治疗将为包括胃癌在内的多种疾病提供新的治疗手段。

1 Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al. Global cancer statistics, 2002[J]. CA Cancer J Clin, 2005, 55 (2): 74-108.

2 Lee Y, Kim M, Han J, et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase Ⅱ[J]. EMBO J, 2004, 23 (20): 4051-4060.

3 Lee Y, Ahn C, Han J, et al. The nuclear RNase Ⅲ Drosha initiates microRNA processing[J]. Nature, 2003, 425 (6956): 415-419.

4 Yi R, Qin Y, Macara IG, et al. Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs[J]. Genes Dev, 2003, 17 (24): 3011-3016.

5 Chendrimada TP, Gregory RI, Kumaraswamy E, et al. TRBP recruits the Dicer complex to Ago2 for microRNA processing and gene silencing[J]. Nature, 2005, 436 (7051): 740-744.

6 Lee Y, Hur I, Park SY, et al. The role of PACT in the RNA silencing pathway[J]. EMBO J, 2006, 25 (3): 522-532.

7 Kim VN. MicroRNA biogenesis: coordinated cropping and dicing[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2005, 6 (5): 376-385.

8 Wang M, Li C, Yu B, et al. Overexpressed miR-301a promotes cell proliferation and invasion by targeting RUNX3 in gastric cancer[J]. J Gastroenterol, 2013, 48 (9): 1023-1033.

9 Zhang X, Li X, Tan Z, et al. MicroRNA-373 is upregulated and targets TNFAIP1 in human gastric cancer, contributing to tumorigenesis[J]. Oncol Lett, 2013, 6 (5): 1427-1434.

10 Zhu LH, Liu T, Tang H, et al. MicroRNA-23a promotes the growth of gastric adenocarcinoma cell line MGC803 and downregulates interleukin-6 receptor[J]. FEBS J, 2010, 277 (18): 3726-3734.

11 An J, Pan Y, Yan Z, et al. MiR-23a in amplified 19p13.13 loci targets metallothionein 2A and promotes growth in gastric cancer cells[J]. J Cell Biochem, 2013, 114 (9): 2160-2169.

12 Zhang Z, Li Z, Gao C, et al. miR-21 plays a pivotal role in gastric cancer pathogenesis and progression[J]. Lab Invest, 2008, 88 (12): 1358-1366.

13 Zhang Y, Lu Q, Cai X. MicroRNA-106a induces multidrug resistance in gastric cancer by targeting RUNX3[J]. FEBS Lett, 2013, 587 (18): 3069-3075.

14 Zhang Y, Fan KJ, Sun Q, et al. Functional screening for miRNAs targeting Smad4 identified miR-199a as a negative regulator of TGF-beta signalling pathway[J]. Nucleic Acids Res, 2012, 40 (18): 9286-9297.

15 Lo SS, Hung PS, Chen JH, et al. Overexpression of miR-370 and downregulation of its novel target TGFβ-RⅡ contribute to the progression of gastric carcinoma[J]. Oncogene, 2012, 31 (2): 226-237.

16 Hsu KW, Wang AM, Ping YH, et al. Downregulation of tumor suppressor MBP-1 by microRNA-363 in gastric carcinogenesis[J]. Carcinogenesis, 2014, 35 (1): 208-217.

17 Jin Z, Selaru FM, Cheng Y, et al. MicroRNA-192 and -215 are upregulated in human gastric cancerinvivoand suppress ALCAM expressioninvitro[J]. Oncogene, 2011, 30 (13): 1577-1585.

18 Tang H, Deng M, Tang Y, et al. miR-200b and miR-200c as prognostic factors and mediators of gastric cancer cell progression[J]. Clin Cancer Res, 2013, 19 (20): 5602-5612.

19 Song YX, Yue ZY, Wang ZN, et al. MicroRNA-148b is frequently down-regulated in gastric cancer and acts as a tumor suppressor by inhibiting cell proliferation[J]. Mol Cancer, 2011, 10: 1.

20 Zeng JP, Fang M, Wang LX, et al. MicroRNA-212 inhibits proliferation of gastric cancer by directly repressing retinoblastoma binding protein 2[J]. J Cell Biochem, 2013, 114 (12): 2666-2672.

21 Zhang L, Liu X, Jin H, et al. miR-206 inhibits gastric cancer proliferation in part by repressing cyclinD2[J]. Cancer Lett, 2013, 332 (1): 94-101.

22 Gong J, Li J, Wang Y, et al. Characterization of microRNA-29 family expression and investigation of their mechanistic roles in gastric cancer[J]. Carcinogenesis, 2014, 35 (2): 497-502.

23 Wu J, Qian J, Li C, et al. miR-129 regulates cell proliferation by downregulating Cdk6 expression[J]. Cell Cycle, 2010, 9 (9): 1809-1818.

24 Chang L, Guo F, Wang Y, et al. MicroRNA-200c regulates the sensitivity of chemotherapy of gastric cancer SGC7901/DDP cells by directly targeting RhoE[J]. Pathol Oncol Res, 2014, 20 (1): 93-98.

25 Gao P, Xing AY, Zhou GY, et al. The molecular mechanism of microRNA-145 to suppress invasion-metastasis cascade in gastric cancer[J]. Oncogene, 2013, 32 (4): 491-501.

26 Zhou L, Zhao X, Han Y, et al. Regulation of UHRF1 by miR-146a/b modulates gastric cancer invasion and metastasis[J]. FASEB J, 2013, 27 (12): 4929-4939.

27 Lei H, Zou D, Li Z, et al. MicroRNA-219-2-3p functions as a tumor suppressor in gastric cancer and is regulated by DNA methylation[J]. PLoS One, 2013, 8 (4): e60369.

28 Yao Q, Cao Z, Tu C, et al. MicroRNA-146a acts as a metastasis suppressor in gastric cancer by targeting WASF2[J]. Cancer Lett, 2013, 335 (1): 219-224.

29 Deng M, Tang HL, Lu XH, et al. miR-26a suppresses tumor growth and metastasis by targeting FGF9 in gastric cancer[J]. PLoS One, 2013, 8 (8): e72662.

30 Eto K, Iwatsuki M, Watanabe M, et al. The microrna-21/pten pathway regulates the sensitivity of her2-positive gastric cancer cells to trastuzumab[J]. Ann Surg Oncol, 2014, 21 (1): 343-350.

31 Chen Y, Zuo J, Liu Y, et al. Inhibitory effects of miRNA-200c on chemotherapy-resistance and cell proliferation of gastric cancer SGC7901/DDP cells[J]. Chin J Cancer, 2010, 29 (12): 1006-1011.