糖尿病患者胃平滑肌细胞超微结构变化以及收缩蛋白表达与糖基化终末产物的关系*

王庆娥 朱 滢 王 云 孙晓萌 林 琳

南京医科大学第一附属医院消化科(210029)

糖尿病性胃轻瘫(diabetic gastroparesis, DGP)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)患者的常见并发症之一，临床表现主要包括腹痛、腹胀、恶心、呕吐、早饱。DGP的发病机制尚未完全明确，研究认为高血糖、高氧化应激、胃肠神经病变、免疫调节异常、Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal, ICCs)丢失、平滑肌细胞(smooth muscle cells, SMC)病变等均可能与之相关[1]。胃肠运动需神经元、ICCs、SMC以及多种胃肠激素共同参与，SMC是运动的最终执行者，但目前大多数研究关注于ICCs与神经病变，SMC相关研究较少见。糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)是蛋白质、脂质、核酸等物质通过非酶糖基化反应，自发与葡萄糖或其他还原单糖反应生成的稳定共价化合物[2]，Nε-羧甲基赖氨酸(Nε-carboxymethyllysine, CML)是AGEs的重要组分，可反映体内AGEs含量[3]。本研究通过观察DM患者胃SMC超微结构的变化，检测胃肌层收缩蛋白和AGEs组分CML表达，分析收缩蛋白表达与AGEs的关系，旨在探讨AGEs是否与DM胃平滑肌病变有关。

材料与方法

一、标本获取和实验分组

1. 标本获取：选取2012年7月至2012年12月南京医科大学第一附属医院因胃肿瘤行胃切除术的30例患者的全层胃组织，取材方法参照Faussone-Pellegrini等[4]的研究，取材部位为胃体前壁、距肿瘤边缘>5 cm处，病理显示无肿瘤浸润。排除标准：①年龄<18岁；②既往有腹部手术史；③术前已行放、化疗；④存在系统性红斑狼疮、进行性系统性硬化症、系统性淀粉样变性等可能导致胃轻瘫的疾病；⑤术 前确诊其他胃动力障碍性疾病；⑥肝、胆、胰、肠道存在器质性病变；⑦幽门梗阻、Borrmann Ⅳ型胃癌；⑧术 后病理显示非上皮性肿瘤。所有入选者均签署知情同意书。

2. 实验分组：30例患者中DM和非DM各15例，分别作为DM组和对照组。DM组：术前确诊合并2型DM，DM病程>5年；对照组：术前无DM且入院时血糖正常。

二、主要试剂

RIPA裂解液(碧云天生物技术研究所)，BCA蛋白定量试剂盒(美国Pierce公司)，小鼠抗人肌球蛋白重链(MHC)单克隆抗体、兔抗人α-肌动蛋白(α-actin) 单克隆抗体、兔抗人钙调节蛋白(calponin)单克隆抗体、兔抗人CML多克隆抗体(美国Abcam公司)，TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)，逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]。

三、方法

1. 胃SMC超微结构观察：胃组织标本取材后迅速于冰上切出约1 mm3的环肌层组织，3%戊二醛固定，锇酸后固定，乙醇、冰丙酮系列脱水，纯丙酮+包埋液包埋，烘箱固定，超薄切片机切片，3%乙酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电子显微镜观察、拍照。

2. 蛋白质印迹法检测胃肌层收缩蛋白MHC、α-actin、 calponin以及CML表达：取适量胃肌层组织于液氮研钵中磨成粉状，RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶恒流30 mA 电泳，恒压80 V转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，加入稀释的一抗(MHC 1∶1 000，α-actin 1∶200，calponin 1∶1 000，CML 1∶100，GAPDH 1∶5 000) 4 ℃过夜，TBST洗膜3次，加入HRP标记的二抗，37 ℃温育2 h，TBST洗膜3次，加入ECL显色液，曝光显影。凝胶成像分析系统分析、处理数据，目的蛋白相对表达量以其条带灰度值与内参照GAPDH条带灰度值的比值表示。

3. 荧光定量PCR检测胃肌层收缩蛋白MHC、α-actin、calponin mRNA表达：取适量胃肌层组织于液氮研钵中磨成粉状，按TRIzol试剂说明书提取总RNA，按逆转录试剂盒说明书在10 μL反应体系中逆转录为cDNA，以之为模板行PCR扩增，操作步骤参照荧光定量PCR试剂盒说明书。MHC引物上游：5’-GGT CAC GGT TGG GAA AGA TGA-3’，下游：5’-GGG CAG GTG TTT ATA GGG GTT-3’；α-actin引物上游：5’-GTG TTG CCC CTG AAG AGC A-3’，下游：5’-GCT GGG ACA TTG AAA GTC TCA-3’；calponin引物上游：5’-CTG TCA GCC GAG GTT AAG AAC-3’，下游：5’-GAG GCC GTC CAT GAA GTT GTT-3’；GAPDH引物上游：5’-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3’，下游：5’-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3’。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火20 s，60 ℃延伸20 s，共40个循环。以2-△△Ct法计算目的基因mRNA相对表达量。

四、统计学分析

结 果

一、一般情况

DM组男6例，女9例，平均年龄(58.40±14.11)岁，对照组男8例，女7例，平均年龄(62.33±15.27)岁， 两组间性别构成，平均年龄差异无统计学意义(P>0.05)。DM组DM平均病程为(6.00±3.79)年， 糖化血红蛋白(HbA1c)为7.20%±0.60%， 显

著高于对照组的5.00%±0.60%(P<0.05)。

二、胃SMC超微结构

与对照组相比，DM组胃肌层SMC超微结构明显异常，主要表现为缝隙连接破坏(图1)、胞质内线粒体肿胀、出现脂褐素(图2)、细胞膜小凹数量增加(图3)和细胞膜外基层增厚(图4)。

三、胃肌层收缩蛋白及其mRNA表达

蛋白质印迹法检测结果显示，DM组胃肌层收缩蛋白MHC、α-actin、calponin表达水平较对照组显著降低(P均<0.01)(图5)，同时荧光定量PCR检测结果显示相应mRNA表达水平亦较对照组显著降低，分别为0.73±0.17对1.00±0.16、0.72±0.09 对1.15±0.15和0.74±0.28对 1.14±0.09(P均<0.01)(图6)。

A：对照组胃SMC(黑框中为正常形态线粒体)(×10 000)；B：图A黑框内线粒体放大结果(m所示为线粒体)(×50 000)；C、D：DM组胃SMC(m所示为肿胀的线粒体，箭头所示为脂褐素)(×10 000)

A：对照组胃SMC；B、C：DM组胃SMC

1 Da=0.992 1 u

四、胃肌层CML蛋白表达

蛋白质印迹法检测结果显示，DM组胃肌层CML蛋白表达水平显著高于对照组(2.37±0.39对0.83±0.08)(P<0.01)(图7)。

五、胃肌层收缩蛋白与CML的相关性

Pearson相关系数分析结果显示，DM组胃肌层MHC、 calponin mRNA表达与CML蛋白表达呈负相关(r=-0.59，P=0.02；r=-0.63，P=0.01)，α-actin mRNA表达则与CML蛋白表达无明显相关性(r=-0.49，P=0.06)(图8)。

A：对照组胃SMC；B、C：DM组胃SMC

A：对照组胃SMC；B、C：DM组胃SMC

*P<0.01

讨 论

DGP是常见的DM并发症，既往认为DGP大多发生于1型DM患者，但近年研究[5]显示2型与1型DM患者的DGP发病率相似。目前关于DGP发病机制的研究多通过动物模型完成，直接获取人体胃组织的研究较少。本实验从行胃切除术的DM和非DM患者处获取全层胃组织进行研究，发现DM患者胃肌层SMC超微结构改变明显，表现为缝隙连接破坏、胞质内线粒体肿胀、出现脂褐素、细胞膜小凹数量增多和胞膜外基层增厚。SMC间的连接是其发生电偶联之处，可将信号从一个细胞传递至另一个细胞；线粒体是细胞供能场所；胞膜小凹与钙离子进出密切相关，而钙离子是SMC收缩的关键因素。这些细胞结构破坏可引起SMC收缩功能受损， 导致胃动力障碍。此外， 细胞膜外基层增厚可使SMC弹性减弱、营养障碍和萎缩[4,6]，同样影响细胞收缩功能。

收缩蛋白是参与SMC收缩的重要组分，包括MHC、α-actin、calponin等[7]。MHC头部具有ATP酶活性并存在α-actin结合位点，可水解ATP，与α-actin相互作用，使SMC收缩[8]。Calponin可调节平滑肌收缩，抑制细胞增生，参与维持细胞骨架[9]。本研究发现DM患者胃肌层MHC、α-actin、calponin蛋白和mRNA表达均显著降低，可能导致SMC收缩功能障碍，进而参与DM胃动力障碍的发生。

此外，收缩蛋白亦为SMC的表型标记物[10]。SMC包括两种表型，即收缩表型和增殖表型，前者收缩蛋白高表达，收缩装置完整，具有正常收缩功能；后者产生细胞因子和细胞外基质组分，收缩蛋白表达减少，收缩功能减弱[11]。胃肠道成熟的SMC可在收缩表型与增殖表型间转换[11]。本研究发现DM患者胃肌层收缩蛋白表达减少，推测可能有SMC发生了表型转换，进而导致收缩功能减弱。Calponin是一种多功能蛋白，不仅参与SMC收缩和表型维持，更是一种抗细胞增殖蛋白。停止生长的细胞重新进入细胞周期G期和增殖期时，calponin表达下调[12]。因此，本研究中calponin表达减少证实DM患者可能存在SMC向增殖表型转换。

已知AGEs参与了多种DM并发症的发生，如心血管病、视网膜病变、肾病等[13]。在DM动脉粥样硬化中，AGEs可促进血管SMC增殖，使之向增殖表型转换[14]。但AGEs在DM胃肠病变中的作用仅有部分报道，尚未完全明确。Bhor等[15]的研究指出，DM过程中AGEs可引起小肠刷状缘理化特性改变。Jeyabal等[16]对DM大鼠的研究发现，AGEs可抑制肠神经元一氧化氮合酶表达。Chen等[17]的研究显示，AGEs及其受体在DM大鼠空肠、回肠和结肠中表达升高。本研究发现DM患者胃肌层AGEs重要组分CML表达显著升高，提示AGEs水平升高，且CML表达与收缩蛋白MHC、 calponin表达呈负相关，因此推测AGEs可能参与了DM患者的胃平滑肌病变，具体作用机制有待进一步研究。

A：MHC与CML相关性分析；B：α-actin与CML相关性分析；C：calponin与CML相关性分析

综上所述，DM患者存在胃肌层SMC超微结构破坏，肌层收缩蛋白减少、AGEs增多且两者呈负相关。上述变化可能影响SMC收缩功能，进而参与DM胃动力障碍的发生。AGEs通过何种途径影响胃肌层收缩蛋白表达以及调控收缩蛋白表达的上游机制仍有待研究。本研究的不足之处主要在于：①未行SMC表型转换的检测，以明确DM患者在胃肌层收缩蛋白表达减少的同时是否存在SMC表型转换；②研究缺乏临床胃动力学参数，因此尚不能直接证明这些病变与胃动力障碍有关，亦无法说明其间的因果关系。上述问题将在后续研究中得到进一步明确。

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