酶解小球藻蛋白制备多肽的工艺研究

钟秋平，林美芳，戴梓茹，李慧林

（广西钦州学院海洋学院，广西钦州 535000）

酶解小球藻蛋白制备多肽的工艺研究

钟秋平，林美芳，戴梓茹，李慧林

（广西钦州学院海洋学院，广西钦州 535000）

摘 要：以钦州湾小球藻为原料，通过单因素和正交试验探讨酶解法制备多肽的最佳工艺。实验结果表明：酶解小球藻蛋白制备多肽的最佳工艺条件为：pH 6.5，酶解温度30℃，酶解时间20 min，料液比1∶100 g/mL。此时多肽得率为15.538%±0.2%。

关键词：小球藻；多肽；酶解

小球藻（Chlorella spp.）是一类普生性单细胞绿藻，属于绿藻门（Chlorophyta），绿藻纲（Chlorophyceae），绿藻目（Chlorococcales），卵囊藻科（Oocystaceae），小球藻属（Chlorella pyrenoidosa）[1-2]。通常蛋白质含量较高（55%～67%），有较多的糖类（15%～10%），并含有具有生物活性的藻多糖、植物生长因子、（Chlorella Growth Factors，CGF）、糖蛋白、糖脂蛋白、膳食纤维等[3]。利用酶解法制备生物活性肽，不仅可以提高蛋白质的溶解性，降低小球藻中的不良腥味等负面影响，而且营养成分缺失少，蛋白质水解产生的肽具有易消化吸收和一些蛋白质无法比拟的物理化学特性，因而酶解法成了微藻功能成分的研究、保健食品的开发的一个新热点[4]。山西医科大学证实小球藻具有降低动物血铅和肝铅蓄积的作用，日本等国的动物和临床试验证实小球藻还具有一定的降血压、防便秘、提高机体免疫力等作用[5]，近年来的研究发现，人类摄取蛋白质经消化酶作用后，并非主要以氨基酸的形式吸收，而是以肽的形式吸收。目前已有从大豆、玉米、鱼、和其他微藻蛋白的水解物中成功提取具有生理活性的多肽的报道[6]，但对富含蛋白质的小球藻加工制备生物活性多肽的工艺相关的报道还较少。在前期有关研究的基础上，本研究以钦州港小球藻为原料，对酶解工艺中的多个影响因素进行研究，优化确定小球藻蛋白制备多肽的工艺参数，这对于充分开发利用小球藻中的蛋白质资源、多肽的生理活性研究以及进一步开发功能食品具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 实验材料

钦州湾小球藻（自行分离）、钦州湾海水。

胰蛋白酶，≥2 500 U/mg，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 制备多肽的工艺流程

小球藻粉→超声波破碎→加入蛋白酶→灭酶活→冷却→磷钼酸沉淀→离心→取上清液→测定多肽的含量

1.2.2 测定方法

1.2.2.1 标准曲线的绘制

配置不同浓度的牛血清白蛋白溶液（BSA）标准溶液，分别为 0、100、200、300、400、600、800 μg/mL，以生理盐水做参比，在595 nm波长处，用考马斯亮蓝结合法测溶液吸光度，并绘制标准曲线[7]。

1.2.2.2 多肽含量测定

多肽含量测定采用磷钼酸沉淀法[8]：在灭酶后的酶解液中加入2 mL的磷钼酸溶液，摇匀，离心，取1 mL上清液，用考马斯亮蓝法测定吸光值，对照牛血清蛋白标准曲线算出多肽的质量。多肽质量分数/%=多肽质量/总蛋白质质量分数×稀释倍数×100

1.2.3 单因素试验

根据预实验结果选择胰蛋白酶为实验用酶。称取一定量藻泥悬浮于10 mL pH 7.0的0.01 mol/L磷酸缓冲液（PBS）中，用超声波（280 W，时间30 min）破碎的方法破碎小球藻的细胞壁并进行提取，加入胰蛋白酶进行酶解反应一定时间后，加热灭活酶（100℃，15 min），冷却后用磷钼酸沉淀并用离心机在4 000 r/min的转速下离心10 min，取上清液，用考马斯亮蓝结合法测定多肽的含量，计算多肽的得率。

1.2.4 正交试验

根据单因素实验结果，采用L9（34）正交试验的方法，探讨温度、pH、酶解时间和料液比这4个因子对提取多肽含量的影响。因素水平见表1。

表1 因素水平表Table 1 The level of form factors

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

绘制牛血清蛋白标准曲线如图1，建立回归线方程 y=0.005 0x，R2=0.999 3。

2.2 单因素试验

2.2.1 最佳酶解的温度选择

分别在 25、30、35、40、45 ℃下进行酶解，实验结果如图2，表明温度对多肽的得率影响显著，温度为30℃时酶解多肽得率最高，为9.23%。酶解温度太高或者太低都会影响多肽的得率，原因是温度过高，会引起蛋白酶失活。因此，选择30℃作为最佳酶解温度。

图1 牛血清蛋白标准曲线Fig.1 The standard curve of bovine serum albumin

图2 酶解温度对多肽得率的影响Fig.2 The effect of enzyme solution temperature on the peptide yield

2.2.2 pH的选择

分别调节磷酸缓冲液（PBS）的 pH 为 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 进行实验，结果如图 3。

图3 pH对多肽得率的影响Fig.3 The effect of pH on the peptide yield

图3表明pH在6.0～6.5的范围内多肽的得率是增加的，到了6.5时达到最高，pH超过了6.5后，多肽的得率越来越低。因此，选择6.5为最适pH。

2.2.3 酶解时间的选择

分别以酶解时间为 20min、30min、60min、120min进行实验，结果如图4所示。

图4 酶解时间对多肽得率的影响Fig.4 The effect of the enzyme solution time on the peptide yield

由图4可知，酶解时间为30 min的时候多肽的得率最高，为10.57%，且时间增长，多肽的得率呈下降趋势，原因可能是放置的时间越长，多肽被微生物降解得越多。因此，30 min为最佳酶解时间。

2.2.4 料液比的选择

用pH 7.0的0.01 mol/L磷酸缓冲液（PBS）配制浓度为40 U/mL的酶液。分别在100 mL酶液中添加0.5、1、2、3、4 g 的藻粉进行实验，即料液比分别为 0.5∶100、1∶100、2∶100、3∶100，4∶100 g/mL。结果如图 5 所示。

图5 料液比对多肽得率的影响Fig.5 The effect of ratio of material to solvent on the peptide yield

由图5可知，当料液比在1∶100 g/mL时达到多肽的得率最大，因此，1∶100 g/mL的料液比最合适。

2.3 正交试验结果与分析

在单因素实验基础上，以 温度（A）、pH（B）、酶解时间（C）和料液比（D）为因素，进行正交试验，以优化小球藻蛋白制备多肽的工艺。正交试验结果如表2。

表2 最优水解条件的正交试验结果Table 2 The optimal conditions of orthogonal experimental results

通过正交试验优化，对表2结果进行极差分析表明，4个因素中对小球藻蛋白制备多肽影响顺序为：C＞A＞B＞D，温度和pH对多肽得率的影响最大，时间、料液比的影响较小。最优提取工艺为A2B3C1D2，即小球藻蛋白制备多肽的最佳实验条件是：pH6.5，温度30℃，时间20 min，料液比1∶100 g/mL，这与单因素实验结果并不完全一致，可能是因为各影响因素之间的相互影响所致。此时多肽最高得率为15.41%。

为了验证正交实验的结果，在得出的最佳实验方案的基础上，重复实验，以验证试验结果的正确性。实验结果表明在pH6.5，温度30℃，时间20 min，料液比1∶100 g/mL 的条件下，多肽得率为（15.538±0.2）%。

3 结论

本实验通过酶解钦州湾小球藻制备多肽，通过正交实验对pH值、酶解温度、酶解时间和料液比这四个因子进行优化，得到最佳工艺条件。实验证明，酶解法对钦州湾小球藻制备多肽具有很好的促进作用。其最佳的工艺条件为：pH6.5，酶解温度30℃，酶解时间20 min，料液比1∶100 g/mL。在此条件下进行验证实验，多肽得率为（15.538±0.2）%，优于正交试验所得的结果。因此，正交试验的结果可靠。

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[1]李扬汉.植物学[M].上海:上海科学技术出版社,1988:255－258

[2]华汝成.单细胞藻类的培养与利用[M].北京:农业出版社,1986:23－32

[3]刘世明.小球藻高密度异养培养[D].广东:华南理工大学,1999

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Study on Enzymatic Preparation of Polypeptides from Chlorella Protein

ZHONG Qiu-ping，LIN Mei-fang，DAI Zi-ru，LI Hui-lin
（Department of Marine Science，Qinzhou University，Qinzhou 535000，Guangxi，China）

Abstract：In this study， using single factor and orthogonal experiments， the prepare process optimization of polypeptides from chlorella protein of Qinzhou Bay were investigated by enzyme hydrolysis.The results showed that optimum conditions for prepare polypeptides were as follows：pH is 6.5，the hydrolysis temperature and time is 30℃and 20 min，chlorella was mixed with phosphate buffer at ratio of 1∶100 g/mL.At the condition，yield of polypeptides is 15.538%±0.2%.

Key words：chlorella； polypeptide； enzymolysis

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.06.015

广西自然科学基金项目（2010GXNSFA013063）

钟秋平（1964—），男（汉），副教授，本科，从事海洋生物资源开发与综合利用研究。

2013－11－10