不同发酵时期添加金属离子对酿酒酵母合成谷胱甘肽的影响

郑丽雪，刘梦滢，王立梅，齐斌，*

（1.常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟 215500；2.苏州市食品生物技术重点实验室，江苏常熟 215500）

不同发酵时期添加金属离子对酿酒酵母合成谷胱甘肽的影响

郑丽雪1，2，刘梦滢1，王立梅1，2，齐斌1，*

（1.常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟 215500；2.苏州市食品生物技术重点实验室，江苏常熟 215500）

摘 要：通过摇瓶发酵培养，研究了Cu2+，Mg2+，K+，Fe2+，Mn2+5种金属离子在不同发酵时间添加对酿酒酵母CS10515-1 生产谷胱甘肽的影响。实验结果表明：在发酵初期（0 h），当 K+、Mg2+、Fe2+添加量分别为 0.15、0.12、0.09 g/L时，GSH的产量分别为88.53、52.73、41.42 mg/L，相比空白对照分别提高了63.50%、36.58%和44.25%。在15 h时，当Mg2+添加量为0.09 g/L时，GSH产量为61.75 mg/L，比对照组提高82.01%。当发酵至24 h时，金属离子的添加对GSH的产量无明显促进作用。

关键词：谷胱甘肽；酿酒酵母；金属离子

谷胱甘肽（GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合而成的三肽化合物，其分子中含有γ-谷氨酰基和活性巯基，是GSH许多重要生理功能的结构基础[1]，例如：它是许多酶反应的辅基，可作为抗氧化剂[2]保护生物分子蛋白的巯基，清除体内过多的自由基，参与体内三羧酸循环以及糖代谢，具有预防糖尿病以及消除疲劳等作用[3-4]。

目前，利用酵母发酵生产GSH是最具潜力的方法[5]。GSH在生物体内的合成由两步依靠ATP的酶促反应构成，这两步反应都需要ATP和金属离子的参与[6]。另外金属离子对于酵母体内高效大量的合成ATP也有显著影响[7]。因此，从金属离子添加角度考察发酵过程谷胱甘肽产量有十分重要的意义。本文考察了在不同时间添加不同浓度的 Cu2+，Mg2+，K+，Fe2+，Mn2+对酿酒酵母生产谷胱甘肽的影响，旨在为以后的放大实验提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 菌种

本实验室保存的经化学诱变选育的酿酒酵母CS10515-1。

1.2 仪器与设备

UV-1240型紫外可见分光光度计：日本岛津公司；Milli-QAdvantage超纯水仪；美国Millipore公司；XSIO5DU型电子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；CR22GⅡ型高速冷冻离心机：日本日立公司。

1.3 培养基

斜面培养基：PDA 培养基[12]；种子培养基：5°B′e 麦芽汁；发酵培养基：5°B′e麦芽汁。

1.4 麦芽汁的制备[8]

麦芽汁制备方法同文献[8]。本实验中，将制备好的 10°B′e 麦芽汁用波美计调配成 5°B′e。

1.5 培养方法

将活化好的一级种子以10%（体积分数）接种量接入二级种子培养基中，30℃、180 r/min培养18 h，然后以10%接种量转接入发酵培养基中，温度30℃、180 r/min培养33 h。

1.6 金属离子添加对GSH发酵的影响

分别考察0、15、24 h向发酵液中添加0.09 g/L的CuSO4、MgSO4、KCl、FeSO4、MnSO45 种 金 属 盐 对 GSH产量及生物量的影响。确定对谷胱甘肽产量及生物量有促进作用的金属离子，然后优化金属离子的最佳添加量。以不添加金属离子作为空白对照，每个实验做3个平行。

1.7 测定方法

生物量测定[8]；残糖量测定[9]；GSH 产量测定[8]。

2 结果与分析

2.1 不同时间不同浓度金属离子添加对谷胱甘肽发酵的影响

根据摇瓶发酵曲线，GSH的整个摇瓶发酵过程分为3个阶段，分别是指数生长期（0～18h），平稳期（18 h～26 h），细胞衰亡期（26 h～48 h）。由于谷胱甘肽为酿酒酵母的次级代谢产物，当细胞生长至平稳期时大量合成，因此分别考察了不同细胞生长时期添加不同浓度的金属离子对于细胞合成谷胱甘肽的影响。

2.1.1 发酵初始添加金属离子对GSH产量及生物量的影响

发酵初始添加 Cu2+、Mg2+、K+、Fe2+、Mn2+对 GSH 产量的影响及生物量影响见图1。

由图1可知，发酵初期添加Mg2+、Fe2+、K+及Mn2+对GSH产量都有促进作用，此结论与Chi-Hsien Liu[10]、Tao Zhang[11]、Tan Zuo-Ping[12]、Jae-Young Cha[13]等在关于谷胱甘肽培养基优化的研究中的结论是一致的。可能由于在发酵初期细胞处于指数生长初期，细胞代谢较为迅速，酶系较为活跃，上述几种金属离子作为某些酶类的激活剂[14]，能够在一定程度上提高酶的活力，从而促进GSH的合成。

图1 不同金属离子对GSH产量和细胞生物量的影响（0 h）Fig.1 Effects of different metal ions on glutathione production and biomass

在此基础上，分别考察了对谷胱甘肽产量有显著提高作用的3种金属离子的最佳添加量，优化后结果表明，当 K+，Mg2+，Fe2+添加量分别为 0.15、0.12、0.09 g/L时，GSH 的产量分别为88.53、52.73、41.42 mg/L，相比空白对照组分别提高了63.50%、36.58%和44.25%。

2.1.2 对数生长期后期（15 h）添加不同金属离子对GSH产量及生物量的影响

对数生长期后期（15 h）添加 Cu2+、Mg2+、K+、Fe2+、Mn2+对GSH产量及生物量的影响见图2。

图2 不同金属离子对GSH产量及细胞生物量的影响（15 h）Fig.2 Effects of different metal ions on glutathione production and biomass

由图2可知，发酵至15 h时，发酵液中添加Mg2+对GSH产量及生物量都有明显的促进作用，Mg2+的添加使GSH产量达到76.76 mg/L，相比对照组提高了39.70%。在酿酒酵母体内，GSH作为次级代谢产物在细胞生长至稳定期时大量合成，GSH生物合成由两步依靠ATP的酶促反应构成，而且在反应时需要Mg2+的参与[6]，所以当细胞生长至对数生长期后期时向发酵液中添加Mg2+比发酵初始添加效果更好。进一步优化Mg2+添加量，最适添加量为0.09 g/L。

2.1.3 稳定期（24 h）添加不同金属离子对GSH产量及生物量的影响

稳定期（24 h）添加 Cu2+、Mg2+、K+、Fe2+、Mn2+对 GSH产量及生物量的影响见图3。

图3 添加金属离子对GSH产量和细胞生物量的影响（24 h）Fig.3 The influence of different metal ions on GSH production and biomass

由图3可知，当发酵至24 h时，细胞生长至稳定期，此时向发酵液中添加金属离子对谷胱甘肽产量及生物量都起到了抑制作用，其中Cu2+对其影响最大。稳定期时，发酵液中的碳源几乎消耗殆尽，ATP合成量少，对细胞中GSH的合成不利因素增多，所以金属离子的添加对于谷胱甘肽的合成不起作用，甚至对细胞还会起到毒害作用。如Cu2+可以诱导酵母细胞内活性氧的产生，活性氧可以参与破坏细胞膜的流动性和渗透性，夺取质膜和细胞器膜中不饱和脂肪酸的氢离子引起膜脂过氧化[15]。

3 结论

本文研究了当细胞处于不同生长时期向发酵液添加金属离子对GSH产量及生物量的影响。结果表明：

在发酵初始（0 h）添加 Mg2+、K+、Fe2+有利于促进GSH 的合成。当 K+、Mg2+、Fe2+添加量分别为 0.15、0.12、0.09 g/L 时，GSH 的产量分别为 88.53、52.73、41.42 mg/L，相比空白对照分别提高了63.5%、36.58%和44.25%。

当发酵至15 h，发酵液中添加Mg2+对GSH产量有促进作用，当Mg2+添加量为0.09 g/L时，GSH产量达最大，为61.75 mg/L，比对照组提高82.01%。

当发酵至24 h时，5种金属离子对酿酒酵母合成谷胱甘肽及生物量均无促进作用。

金属离子对于酵母体内高效大量的合成ATP有显著影响，进而对于生物体内谷胱甘肽的合成影响很大，所以研究金属离子的添加对谷胱甘肽产量及生物量的影响为后续实验奠定了基础。从上述结果看，不同阶段铜离子的添加都对GSH产量及生物量起到了抑制作用，而杜君等的实验结果表明，适宜浓度的铜离子可以氧化胁迫酿酒酵母细胞内过量积累谷胱甘肽，所以，对于不同的菌种，起到正向胁迫作用的铜离子的浓度会相差很大，有待于我们进行进一步的研究，另外，在以后的实验中可以考虑将起到胁迫和辅酶作用的金属离子同时添加去提高谷胱甘肽产量，为后续的放大实验及工业化生产提供理论依据。

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Effects of Metal Ions on Glutathione Production by Saccharomyces Cerevisiae under Different Fermentation Times

ZHENG Li-xue1，2，LIU Meng-ying1，WANG Li-mei1，2，QI Bin1，*
（1.College of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China；2.Suzhou Key Laboratory of Food and Biotechnology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

Abstract：The effect of Cu2+，Mg2+，K+，Fe2+，Mn2+under different fermentation times on GSH fermentation by saccharomyces cerevisiae CS10515-1 were investigated in this paper.It was found that GSH production was 88.53 mg/L，52.73 mg/L，41.42 mg/L respectively，which increasing by 63.50%，36.58%and 44.25%than the controls under the conditions of adding amount was 0.15 g/L K+，0.12 g/L Mg2+and 0.09 g/L Fe2+at 0 hour.GSH production was 61.75 mg/L，which increasing 82.01%under the conditions of 0.09 g/L Mg2+at 15h.Metal ions's adding had no effect on GSH production at 24 h.

Key words：glutathione；Saccharomyces cerevisiae；metal ion

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.06.027

国家自然科学基金资助项目（31171758）；2011年度常熟理工学院“青蓝工程”优秀青年骨干教师培养对象

郑丽雪（1982—），女（汉），实验师，硕士，研究方向：食品生物技术。

齐斌（1965—），男（汉），研究员，博士，研究方向：粮食油脂与植物蛋白工程。

2013-01-05