超声波辅助酶法水解寻氏肌蛤蛋白

孔美兰，刘谋泉，孔德虎，袁秀霞，林继娜，沈少游，吴悦婷

（1.韩山师范学院生物系，广东潮州 521041；2.泰兴市一鸣生物制品有限公司，江苏泰兴 225433）

超声波辅助酶法水解寻氏肌蛤蛋白

孔美兰1，刘谋泉1，孔德虎2，袁秀霞1，林继娜1，沈少游1，吴悦婷1

（1.韩山师范学院生物系，广东潮州 521041；2.泰兴市一鸣生物制品有限公司，江苏泰兴 225433）

摘 要：采用超声波辅助中性蛋白酶水解寻氏肌蛤，以-氨基态氮含量为检测指标。首先采用单因素和正交优化试验L9（34）确定酶法水解薄壳肉蛋白的最适条件．研究结果为：pH6.5，水解时间5 h，温度55℃，酶浓度2.0%，料液比1∶2，水解液的α-氨基态氮含量为0.372 6 g/100 mL。在此基础上，研究功率300 W的超声波预处理对酶解效果的影响，综合考虑，采用超声波预处理10 min，α-氨基态氮含量提高到0.394 1 g/100 mL。

关键词：寻氏肌蛤；中性蛋白酶；超声波；酶解

寻氏肌蛤（Musculus senhousei），俗称薄壳，具有易养殖，生长快，产量大，价格低的特点。汕头大学研究人员研究发现，薄壳蛋白质含量高达10.48%，比有“海洋牛奶”之称的牡蛎还高出近一倍；组成氨基酸比例合理；矿物质含量明显高于其他海洋贝类生物，尤其具有抗癌作用的元素硒含量很高，是一种优质动物蛋白资源[1]。

寻氏肌蛤在每年的5、6月份大量上市，主要用于鲜食，少量经粗加工成薄壳米出售或者作为优质海鱼鱼苗期饲料[2]。集中上市时，由于鲜食量有限，造成薄壳大量积压，价格一再走低，导致养殖户增产不增收。因此有必要进行薄壳深加工的研究。

由于寻氏肌蛤是潮汕地区的特有资源，所以目前对其加工利用方面的研究几乎没有。本研究对寻氏肌蛤蛋白通过酶解将大分子蛋白质降解为多肽、小肽及氨基酸，以利于人体的消化吸收，或者作为方便食品的海鲜调味料的主要原料，以及可以作为食品的营养强化剂，可大大提高其营养价值和商业价值，同时也有利于其贮存。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

寻氏肌蛤：购于潮州枫春水产批发市场；中性蛋白酶（南宁庞博生物技术有限公司，酶活力3 000 U/mg）；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器和设备

TD-5型台式离心机：长沙英泰仪器有限公司；pH S-25型酸度计：上海伟业仪器厂；WFZUV-2102PC紫外分光光度计：尤尼柯（上海）上海仪器有限公司；SB-5200超声波清洗机（300 W）：上海新芝生物技术研究所；JJ-2型组织捣碎机：江苏省金坛市荣华仪器有限公司；控温式磁力搅拌器：常州国华仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

寻氏肌蛤→蒸煮→脱壳、取肉→称量→调节pH→按比例加入酶→（超声波处理）→在一定温度下水解→灭酶（沸水浴10 min）→冷却至室温→离心10 min收集上清液→测定α-氨基态氮含量

（注：超声波处理在酶解试验的单因素和优化试验中不做。）

1.3.2 分析检测方法

蛋白酶活力的测定[3]：福林酚法；粗蛋白[4]：微量凯氏定氮法；氨基态氮含量[4]：甲醛滴定法。

1.3.3 试验设计

1.3.3.1 单因素对中性蛋白酶酶解效果的影响

1）料液比对酶解效果的影响

分别采用料液比为 1∶ 1；1∶1. 5；1∶ 2；1∶2. 5；1∶3（g/mL），在 pH7.0，温度 50℃，酶浓度为 1.0%，水解时间为6 h条件下进行酶解反应，研究料液比对酶解效果的影响。

2）酶浓度的影响

根据以上试验，设定料液比为1∶2，在pH7.0，温度50℃，改变酶浓度为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，然后水解6 h，研究酶浓度对酶解效果的影响。

3）温度对酶解效果的影响

根据以上试验，设定中性蛋白酶酶浓度1.5%，料液比为 1∶2，pH7.0，分别于 40、45、50、55、60、65 ℃条件下水解时间6 h，研究温度对水解度的影响。

4）pH对酶解效果的影响

根据以上试验，设定中性蛋白酶酶浓度1.5%，料液比为 1∶2，温度 55 ℃，分别在 pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0等不同pH中进行酶解6 h，研究不同的pH对酶解效果的影响。

5）时间对酶解效果的影响

根据以上试验，设定中性蛋白酶酶浓度1.5%，料液比为1∶2，温度55℃，pH7.0，分别在水解时间为2、3、4、5、6、7、8 h 条件下进行酶解反应，研究酶解时间对水解效果的影响。

1.3.3.2 中性蛋白酶最佳工艺条件的确定[5]

根据以上单因素试验结果，酶浓度、水解时间、水解温度、体系pH以及料液比均对酶解效果有一定的影响。考虑到酶解过程是受到以上各因素的综合影响，因此进行L9（34）正交试验，以确定其最佳酶解条件，其中料液比固定在1∶2。正交试验因素水平表见表1。

表1 中性蛋白酶的正交试验因素水平表Table 1 Level and factors of hydrolyzation of neutral proteinase

1.3.3.3 超声波辐射对酶解效果的影响

在正交试验的基础上，研究额定功率300 W的超声波预处理对后期蛋白质水解效果的影响。试验采用超声波清洗机对酶解前的料液分别作用10、20、30 min，接着在最佳条件下进行水解。

2 结果与分析

2.1 中性蛋白酶酶解条件单因素试验结果

2.1.1 料液比对酶解效果的影响

料液比对酶解效果的影响，见图1。

图1 料液比对水解效果影响曲线Fig.1 Effect of ratio of solid and liquid on hydrolyzation

由图1可知，随着料液比值的降低，反应体系中的水分增加，α-氨基态氮的生成量逐渐升高，直至料液比为1∶2时达到最高，之后随着料液比值的继续下降，α-氨基态氮生成量下降。出现上述现象的原因是，随着料液比的下降，反应体系中水分会增加，从而降低了反应产物的浓度，减轻了产物对反应的抑制作用。但是，随着反应体系中水分的增加，酶的浓度相应的会下降影响了α-氨基态氮的进一步提高。因此选择料液比为1∶2。

2.1.2 酶浓度的影响

酶浓度对水解效果的影响，见图2。

图2 酶浓度对水解效果影响曲线Fig.2 Effect of density of protease on hydrolyzation

由图2可看出，随着酶浓度的增加α-氨基酸态氮含量在不断升高，当酶浓度超过1.5%继续增加酶浓度时，α-氨基酸态氮含量增加不明显。从节约成本考虑，将酶浓度设定为1.5%。

2.1.3 温度对酶解效果的影响

温度对酶解效果的影响，见图3。

图3 水解温度对水解效果影响曲线Fig.3 Effect of temperature on hydrolyzation

由图3可知：从温度40℃升到55℃的过程，α-氨基态氮含量急剧增加；在超过55℃以后，随温度的上升，α-氨基态氮含量有所下降，分析原因可能是温度过低，酶活比较低；而温度过高则导致酶逐渐失活。因此选择水解温度为55℃。

2.1.4 pH对酶解效果的影响

pH对酶解效果的影响，见图4。

图4 pH对水解效果影响曲线Fig.4 Effect of pH on hydrolyzation

由图4中可看出，pH5.0时α-氨基态氮含量相当低，表明蛋白酶在低pH值时作用不明显。随pH的升高，酶解产物中α-氨基态氮含量不断升高。当pH处于7.0左右时候酶解效果最好，而当pH值超过8.0继续升高时，α-氨基态氮含量反而下降。因此选择pH7.0为最佳条件。

2.1.5 时间对酶解效果的影响

时间对酶解效果的影响，见图5。

图5 酶解时间对水解效果影响曲线Fig.5 Effect of time on hydrolyzation

由图5可知，反应开始的2 h内，反应速度较慢，所以α-氨基态氮含量增加幅度较小；在2 h～5 h之间α-氨基态氮增加幅度有所增强；超过5 h之后α-氨基态氮基本上无变化，水解基本完成。此外，从节省能耗和防止水解液变质方面来考虑，控制反应的最佳时间在4 h～6 h之间。

2.2 中性蛋白酶最佳工艺条件的确定

表2 中性蛋白酶酶解条件L9（34）正交试验设计与结果分析Table 2L9（43）orthogonal design and result of hydrolyzation of neutral proteinase

由表2可知，加酶量是影响水解效果的最主要因素，pH是次要因素，水解时间和温度对酶解程度的影响较小。单从α－氨基态氮含量来考虑，最佳处理条件为 A2B1C2D3，即 55℃，pH6.5，加酶量 2.0%，水解时间为5 h。在此最适条件下水解，测定水解液的α－氨基态氮含量为0.372 6 g/100 mL＞0.349 5 g/100 mL（正交表中的最大值），说明正交试验成功，结果可靠。

2.3 超声波辐射对酶解的影响

朱国辉[6]等报道，超声波在介质中传播时，加速了介质中的质量传递作用。这有利于反应底物进入酶的催化部位及产物进入介质的传质作用，从而表现出酶活性的增加。同时，适宜的声场作用也会使蛋白酶分子的构象发生变化，使其折叠更合理，更容易与底物结合成中间产物，从而提高酶的催化活力。

图6 超声波预处理对蛋白水解效果的影响Fig.6 Effect of ultrasonic pretreatment on hydrolyzation

由图6可知，经超声波处理后，当超声波作用时间在20 min内时，随着作用时间的延长α－氨基态氮生成量增加；当作用时间在20 min至30 min之间时，随着作用时间的延长α－氨基态氮生成量有所降低。这是由于，短时间的超声波作用使内源蛋白酶组织发生了破裂，有利于酶与蛋白质的接触，体现出作用后水解效果有所改善[6]。当超声波作用达到一定能量水平时，破碎酶组织的同时进一步破坏了酶的内部结构而致使部分酶失活，起到一定的负作用。当这种负作用大于激活作用时，就会表现出α－氨基态氮生成量有所下降，表现出超声波作用20 min的激活效果最好。由于超声波10 min与20 min相比差距不大，从经济角度考虑，采用超声波10 min预处理，水解液中α－氨基态氮含量为0.394 1 g/100 mL。

3 结论

1）试验采用中性蛋白酶对薄壳肉进行酶解，通过影响酶解效果的几个因素进行单因素和优化试验，最终得出薄壳肉蛋白水解的最佳条件为：pH6.5，水解时间5 h，温度55℃，酶浓度2.0%，料液比1∶2，水解液的α－氨基态氮含量为0.372 6 g/100 mL。

2）为了进一步提高水解效果，在确定的最佳水解条件下，采用超声波预处理激活内源酶的活力。试验表现功率为300 W的超声波作用20 min的激活效果最好，从节约能源角度考虑，最终采用超声波10 min预处理，α－氨基态氮含量提高到0.394 1 g/100 mL，为进一步综合利用提供了大量的氨基酸和小肽。

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[1]佘纲哲,傅明辉.寻氏肌蛤营养成分分析[J].海洋科学,1996(5):9－11

[2]蔡英亚.寻氏肌蛤的养殖和利用[J].水产与教育,1975(1):9－11

[3]王秀奇,亲属元,高天慧,等.生物化学实验[M].北京:高等教育出版社,1990:177－180

[4]宁正祥.食品分析手册[M].北京:中国轻工业出版社,1998:34－263

[5]邓尚贵,章超桦.利用正交试验优化贻贝水解工艺[J].水产学报,1997,21(2):220－224

[6]朱国辉,黄卓烈,徐凤彩,等.超声波对菠萝果蛋白酶活性和光谱的影响[J].应用声学,2003,22(6):10－14

Enzymolysis of Protein from Musculus Senhousei Assisted by Ultrasonic

KONG Mei-lan1，LIU Mou-quan1，KONG De-hu2，YUAN Xiu-xia1，LIN Ji-na1，SHEN Shao-you1，WU Yue-ting1
（1.Department of Biology，Hanshan Normal University，Chaozhou 521041，Guangdong，China；2.Taixing Yiming Biological Products Co.，Ltd.，Taixing 225433，Jiangsu，China）

Abstract：Using enzymatic extraction methods assisted by ultrasonic to enzymolysisMusculus senhousei， αamino nitrogen content was the index.Firstly，the hydrolysis ofMusculus senhouseiby neutral proteinase through single element experiment and L9（34） orthogonal study were studied.The results showed that optimum hydrolysis conditions were：pH 6.5，hydrolysis time 5 h，temperature 55℃，content of enzyme 2.0%，the solid/liquid ratio was 1∶2.The content of α-amino acid was 0.372 6 g/100 mL.On this basis， we studied the effect of pretreatment on hydrolysis using ultrasonic of 300 W power.The results showed that 10 minters ultrasonic pretreatment can improve enzymolysis evidently and the content of α-amino acid was 0.394 1 g/100 mL.

Key words：Musculus senhousei； neutral proteinase； ultrasonic； enzymolysis

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.06.006

韩山师范学院青年基金项目（LQ200807）

孔美兰（1977—），女（汉），讲师，硕士，主要从事食品生物技术方面的研究。

2013－07－23