猪肉中多种兽药残留液质联用检测技术的研究

张骏，王硕，张燕，何佳，林安清

（1.食品营养与安全省部共建教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457；2.天津市质量技术监督局，天津 300100；3.天津出入境检验检疫局，天津 300461）

猪肉中多种兽药残留液质联用检测技术的研究

张骏1，2，王硕1，张燕1，何佳3，林安清3

（1.食品营养与安全省部共建教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457；2.天津市质量技术监督局，天津 300100；3.天津出入境检验检疫局，天津 300461）

摘 要：建立了可同时检测猪肉中氯丙嗪，丙酰丙嗪，氮哌酮，氟哌啶醇，氮哌醇，咔唑心安多种兽药残留的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，在已有的研究基础上对样品的前处理方法进行了优化和改进，检出限均为0.5μg/kg，平均加标回收率在77.2%～100.3%之间，相对标准偏差（RSD）在4.7%～10.1%之间。该方法简单快速，回收率高，重现性好，方法回收率和精密度满足残留分析规定指标。

关键词：猪肉；兽药；质谱；检测

近年来，猪肉——这种人们较常食用的动物源性食品相继发生了一系列质量安全问题，如“双汇瘦肉精”事件，引起了全社会的广泛关注。我国每年肉类总产量为七千多万吨，其中猪肉为近5 000万t，几乎占肉类产品总产量的三分之二。因此，保证猪肉质量，尤其是加强对其中兽药残留检测至关重要。兽药残留问题关系到千家万户，甚至影响到国计民生和社会稳定，除了较为人所熟知的“瘦肉精”（主要包括盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等）外，还有其它一些兽药也较常在猪等家畜身上使用，同样应引起足够重视[1-2]。

镇静药和beta-受体阻滞药咔唑心安（卡拉洛尔）常用于消除动物的紧张，抑制动物运动，降低消耗促长膘。特别是在转运至屠宰场的过程中使用可降低动物的维持需要和减少途中失重，死亡率。从用药到屠宰一般不超过几小时，这就可能导致在可食部分有这类药物高残留量，食用残留镇静药物的动物组织将有害人体健康，尤其会影响儿童大脑发育[3]。镇静剂类药物具有抑制脑干及大脑皮质，产生安静和减低运动性作用；与麻醉性止痛剂并用，具有神经性安定镇痛作用，但同时也有一定的副作用。吩噻嗪类镇静药物氯丙嗪、乙酰丙嗪和丙酰丙嗪由于具有过敏毒性及易产生阻滞型黄疸和多种皮肤病反应，已被欧盟禁止用于食用性动物[4]，我国也已将氯丙嗪列入食品动物禁用的兽药及其他化合物清单，在所有动物源性食品中不得检出该类药物，因此加强对动物性食品中这类药物的检测具有重要意义。常用镇定药有氯丙嗪（Chlorpromazine）、乙酰丙嗪（Acepromazine）、丙酰丙嗪（Propionylpromazine）、甲苯噻嗪（Xylazine）、地西泮（Diazepam）、氮哌酮（Azaperone）及其代谢物氮哌醇（Azaperol），beta-受体阻滞药为咔唑心安（Carazolol）。

目前对动物性食品中镇静药和咔唑心安的检测方法国内主要是紫外分光光度法、薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、气相色谱-原子发射光谱联用法，气/质联用法（GC-MS），流动注射分光光度法[5-6]，但多为药物纯品分析或人体中血浆、血清、尿样中镇静药物分析，而且检测低限难以达到对欧美出口食品要求。目前尚未见动物组织如肉、肝、肾中镇静药和咔唑心安的检测方法报道。发达国家对上述药物开展的残留分析研究已有多年，近年来应用气/质联用法（GC-MS）和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）技术检测动物源食品中镇静药和咔唑心安取得了进展[7]，但GC-MS方法大多需要衍生化[8]。欧盟官方确证方法（HPLC和TLC）检测步骤比较烦琐，不能一次检测，且都不能用于确证，回收率也较低。欧盟GC-MS确证方法中，甲苯噻嗪（Xylazine）、氮哌醇（Azaperol）、咔唑心安的离子再现性不好，不能用于准确确证。LC-MS/MS法具有较好的灵敏度及高分离鉴别性能，且不需进行衍生化操作，可提高分析效率和定量重现性，是近年来国外对动物源食品中多种镇静药同时检测较先进的技术模式[9-10]。

表1 目标物化学信息一览表Table 1 Chemical information of target veterinary drugs

我国农业部规定氯丙嗪允许使用，但动物组织中不得检出。本研究旨在建立猪肉中多种兽药残留系统分析检测方法，从而进一步提升猪肉及其制品质量安全检测水平。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与样品

1.1.1 材料

液相色谱-串联质谱联用仪：Agilent 1100-API 4000（Agilent公司-AB公司，美国），配有电喷雾电离源和大气压化学电离源，并具有正-负电离方式自动切换功能。高速均质器：转速大于10 000 r/min，T25（IKA公司，德国）。氮气吹干仪：N-EVAP112（OA公司，美国）。涡旋振荡器：231（Fisher Scientific公司，美国）。离心机：转速大于3 000 r/min（北京医疗器械厂，中国）。滤膜：孔径0.22 μm，有机相。

1.1.2 试剂和材料

甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯，叔丁基甲醚、氢氧化钠、磷酸二氢钾均为分析纯，盐酸为优级纯。0.1%甲酸水溶液：取1 mL甲酸溶解于1 000 mL水中。5 mol/L氢氧化钠溶液：称取50.0 g氢氧化钠，用水溶解，定容到250 mL。1 mol/L磷酸二氢钾溶液：pH=3，称取68.045 g磷酸二氢钾用水溶解，用盐酸将溶液的pH调至3.0，定容到500 mL。定容液：0.1%甲酸水溶液：乙腈（8∶2）。标准品：氯丙嗪、氮哌酮、氟哌啶醇、氮哌醇、咔唑心安纯度为99%；丙酰丙嗪纯度为98%。

氯丙嗪、氮哌酮、氟哌啶醇、丙酰丙嗪、咔唑心安标准储备溶液（0.10 mg/mL）：称取适量的标准物质，分别用甲醇配成0.10 mg/mL的标准储备液，在2℃～4℃条件下避光储存。氮哌醇标准储备溶液（1.0 μg/mL）：准确移取1.0 mL氮哌醇标准液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀，配成1.0 μg/mL的标准储备液，在2℃～4℃条件下避光储存。

吸取适量的标准储备溶液，用乙腈配制成混合标准储备溶液，在2℃～4℃条件下避光储存。

根据每种镇定剂及其代谢物的灵敏度和仪器线性范围用空白样品提取液配成不同浓度（ng/mL）的混合标准工作溶液，在2℃～4℃条件下避光储存。

基质提取液：空白样品，操作同上述处理后得到的溶液。基质标准工作溶液：将标准工作溶液混合后在氮吹仪中吹干，以基质提取液溶解，涡旋30 s后即为基质标准工作溶液。

1.1.3 样品

实验所用猪肉购自本地超市。

1.2 方法

1.2.1 提取和净化

称取试样2.00 g（精确到0.01 g）放入50 mL聚丙烯离心管中，加入3 mL 5 mol/L氢氧化钠溶液，并进行涡流混合30 s。在（80±5）℃水浴中放置1 h。在此期间，要对每个测定样品进行两次涡流混合。1 h后，将样品从水浴中取出并冷却至室温。加入12 mL叔丁基甲醚，置于振荡器上高速振荡15 min，离心15 min（转速为4 000 r/min）。吸出上清液，将叔丁基甲醚转移到干净的15 mL的离心管内，待净化。

在上述15mL离心管中加入1mol/L磷酸二氢钾溶液（pH=3）3 mL，振荡 10 min，离心 10 min（4 000 r/min）。将特丁基甲醚层吸出弃去。然后再在磷酸盐缓冲溶液中加入2 mL叔丁基甲醚重复上述步骤。加入1 mL 5 mol/L氢氧化钠溶液摇匀后加入10 mL叔丁基甲醚，振荡15 min，离心5 min（4 000 r/min）。定量吸取叔丁基甲醚转移到一个干净的10 mL的离心管中。在40℃条件下用氮吹仪蒸发至干。在浓缩至干的提取物中加入1 000 μL定容液，进行涡流混合，超声处理10 min。用0.2 μm×13 mm的聚四氟乙烯注射式过滤器过滤样液，将样液转移到试样瓶中，供液相色谱—串联质谱测定。

1.2.2 测定条件

1.2.2.1 液相色谱条件

色谱柱：Allure C18，5 μm，150 mm×2.1mm，3 μm（Waters公司，美国）；柱温：25 ℃；进样量：20 μL；流速：0.3 mL/min。流动相及梯度变化情况见表2。

表2 流动相组成与梯度变化表Table 2 Linear gradient elution conditions

1.2.2.2 质谱条件

离子化方式：电喷雾电离（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；离子源温度：600 ℃；雾化气压力：12 psi；气帘气压力：25 psi；辅助气1压力：40psi；辅助气 2压力：40psi；电喷雾电压：5500V；监测离子对、去簇电压、入口电压、碰撞能量和碰撞室出口电压见表3。

表3 目标物质谱检测参数一览表Table 3 MS/MS parameters of target compounds

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 提取条件的优化

吩噻嗪类化合物为碱性化合物，在碱性条件下，化合物呈分子形态，易被有机相提取。根据文献和事迹测定结果，在pH＞10.5时能够将镇静药完全提取到有机溶剂中。有机溶剂的使用文献报道有乙腈、乙醚、叔丁基甲醚等，比较之下，叔丁基甲醚的提取效率较高。

2.1.2 净化条件的优化

LC－MS/MS具有较高的检测灵敏度，但“脏”的基质背景不仅会抑制目标化合物的离子化效率，大大降低对被测组分的检测灵敏度，而且样品净化不好还会对结果重现性产生很大的影响。根据文献，主要对比了液液分配和固相萃取两种净化方法。液液分配方法主要利用吩噻嗪类的碱性特征，在碱性条件下提取至有机相，再将体系调整为酸性，使被测物成水溶性，此时有机相可用于除去杂质，最后再回调碱性将被测物溶于有机相，吹干定容。实验证明，这种利用酸碱性改变被测物溶解性来净化的方法效果较好。而文献中报道的固相萃取方法通常用乙腈提取，溶液过C18柱净化，我们实验发现，这种方法净化效果也较好，只是氟哌啶醇回收率较低，不能满足同时检测的需要。因此确定采用液液分配方法进行净化。我们还尝试用0.1%甲酸作为水相，净化后不再转移至有机相，直接进样，但发现样品净化效果较差，因此最终选择调酸水溶再调碱脂溶两步分配的方法。这种方法净化步骤较简单，而且叔丁基甲醚溶液较易吹干。

2.2 HPLC操作条件的选择与优化

2.2.1 流动相的选择

吩噻嗪类化合物为碱性化合物，流动相的离子强度和pH对其在C18柱上的分离和保留具有显著影响，适当的pH和离子强度可抑制色谱柱中残存硅醇基的解离和保证吩噻嗪类化合物在流动相中的稳定溶解状态。本方法采用0.1%甲酸水溶液（pH 3.0）和乙腈作为流动相，通过优化试验，采用梯度洗脱方式可实现吩噻嗪类化合物的快速有效分离。最终样品定容液应选择流动相，而用乙腈或甲醇对峰形及保留时间均有影响。

2.2.2 液相色谱柱的选择

文献报道，因吩噻嗪类化合物的胺基能在水中发生解离，色谱柱固定相表面的残存硅醇基和金属离子可通过氢键或离子交换作用强烈吸附吩噻嗪类化合物，会出现色谱峰拖尾、保留时间不稳定或过长，甚至被保留在色谱柱上的现象，导致峰形异常和分离度下降。因此需要选用以高纯硅胶为基体并经端基封闭处理的C18柱、C8柱、苯基柱或非硅胶基的聚合物反相固定相作为分离柱。

本研究实验结果表明在等流速、等比例条件下进行LC－MS/MS分析时，以高纯硅胶为基体的C18柱对各种镇静药的分离和柱效更好一些。该柱对吩噻嗪类化合物具有良好的分离效果和对称的峰形，可满足质谱检测的要求。

2.2.3 进样量

在达到检出限的前提下，进样量越少，色谱峰形对称性越好，定量就越准确。最终确定进样量为10 μL，既满足检测限的要求，且质量色谱峰峰形又好。

2.3 MS操作条件的选择与优化

2.3.1 MS的优化

将被测化合物用甲醇分别配成浓度为1 μg/mL的工作液，用蠕动泵，以ESI+方式电离首先优化第一级质谱Q1 MS，根据ESI+方式电离得到较强的信号响应值，确定电离正负方式和准分子离子（M+1）即母离子峰值，并优化去簇电压（DP）和入口电压（EP）。

2.3.2 MS/MS的优化和子离子的选择

母离子确定后进行第二级质谱MS2优化，根据所获得的各激素二级质谱图，选择子离子。子离子的选择通常按如下几个原则：

1）质荷比m/z大于100，而且尽可能的大；

2）离子强度尽可能的强；

3）子离子优化时应适当多选1个～2个，以便在后期的实验中若有本底与所选子离子的m/z值相同而干扰其测定时舍去。

子离子确定之后，优化离子碰撞电离能（CE）和出口电压（CXP）。

2.4 方法的线性范围

配制5种镇静药及代谢物及咔唑心安的系列标准溶液，其浓度分别为 0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0ng/mL的混合标准溶液，以本方法的测试条件，进样10 μL进行测定，用峰面积对标准溶液中各被测组分的浓度做图，其各目标物在检测范围内均呈线性关系，线性方程和相关系数见表4。

图1 样品添加回收的质量色谱图Fig.1 Total ion current chromatograms of blank pork spiked with target veterinary drugs

表4 线性方程和相关系数Table 4 Linear equations and related coefficient

2.5 方法检测限

根据实际添加试验，镇静药检测方法检测限为0.5 μg/kg。空白猪肉基质添加0.5 μg/kg镇静药及咔唑心安所做回收的质量色谱图见图1。

2.6 方法的回收率

本研究以不含被测镇静药的空白猪肉为基质，作了 0.5、1.0、5.0 μg/kg 3 个水平添加回收率实验，所测5种镇静药及代谢物和咔唑心安的室间平均回收率在77.2%～100.3%之间。

2.7 方法的精密度

采用空白猪肉基质中添加标准的方法进行重复性测定，每个水平为10个样品，相对标准偏差（RSD）在4.7%～10.4%，符合农兽药残检测要求。

3 结论

建立了可同时检测猪肉中氯丙嗪，丙酰丙嗪，氮哌酮，氟哌啶醇，氮哌醇和咔唑心安多残留的LC-MS/MS方法。在已有的研究基础上对样品的前处理方法进行了优化和改进。该方法简单快速，回收率高，重现性好，适用于猪肉及猪肉制品中多种兽药残留的定量检测，方法检出限满足国内外残留限量要求。

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[1]Rokka M,Pe ltonen K.Food Add it Con tam,2006,23(5):470

[2]Canadian Food Inspection Agency Saskatoon Laboratory.AERSP11[S].2005

[3]D Glenn Kennedy,S Armstrong Hewitt,John D G McEvoy,J.Wesley Currie,Andrew Cannavan,W.John Blanchflower and Christopher.Zeranol is formed from spp.Toxins in cattle in vivo[J].Food Additives and Contaminants,1998,15(4):393-400

[4]Anton F Erasmuson,Bryan G Scahill,David M West.Natural Zeranol in the Urine of Pasture-Fed Ainmals[J].J Agric Food Chem.,1994,42(11):2721-2725

[5]国家质量监督检验检疫总局进出口食品安全局,动植物检疫监管司,国际合作(科技)司,中国进出口商品检验技术研究所.动物和动物源食品中兽药残留物分析方法[M].北京:中国轻工业出版社,2003:140-150

[6]汪正范,杨淑敏,吴侔天,等.色谱联用技术[M].1版.北京:化学工业出版社,2001:122-154

[7]蒋宏建,俞克佳,译.电喷雾质谱应用技术[M].1版.北京:化学工业出版社,2005:4-34

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[9]Philippe Delahaut,Pierre-Yves Brasseur,Michel Dubois Journal of Chromatography A,2004,1054(3):373-378

[10]The council of the european union.council directive 2002/657/EC[S].2002

Determination of Residues of Veterinary Drug in Pork by LC-MS/MS

ZHANG Jun1，2，WANG Shuo1，ZHANG Yan1，HE Jia3，LIN An-qing3
（1.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Bureau Quality and Technical Supervision，Tianjin 300100，China；3.Tianjin Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

Abstract：A liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） method for the determination of some residues of veterinary drug （chlorpromazine，azaperone，propionylpromazine，haloperidol，azaperol and carazolol）in pork was developed.The research optimized and improved the sample pretreatment on the basis of existing study.All of the limits of detection （LODs） of these veterinary drug were 0.5 μg/kg.The average recoveries of target drugs ranged from 77.2%－100.3%with relative standard deviations（RSDs） of 4.7%－10.1%.The developed method is the suitable method for the rapid quantitative and reliable determination of veterinary drug residues.The results demonstrated that the sensitivity，accuracy and precision of this method meet the requirements of residue analysis.The method is applicable to detect these residues of veterinary drug in pork.

Key words：pork；veterinary drug；LC-MS/MS； determination

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.06.020

863计划（No 2011AA100806）；国家质检总局重点科研项目（No 2007IK131）

张骏（1982—），男（汉），工程师，博士研究生，主要从事食品安全检测研究。

2012-10-26