仿生酶解法制备抗凝活性土鳖虫工艺研究*

吴小霞 李兴暖 周裔春

(九江学院基础医学院 江西九江 332000)

仿生酶解法制备抗凝活性土鳖虫工艺研究*

吴小霞 李兴暖 周裔春

(九江学院基础医学院 江西九江 332000)

目的研究仿生酶解法水解土鳖虫的条件。方法以APTT和PT为指标，单因素考察仿生酶解法制备土鳖虫的工艺条件。结果土鳖虫酶解条件为：土鳖虫先用37℃人工胃液加入4%(酶底比)胃蛋白酶水解4h，再于人工肠液中加入4%胰蛋白酶水解3h。结论仿生酶解法适于提取具有抗凝活性的土鳖虫。

土鳖虫，仿生酶解法，抗凝活性

土鳖虫(Eupolyphage sinensis Walker )， 又名土元，属节肢动物门昆虫纲蜚蠊目鳖蠊科昆虫，为《中华人民共和国药典》记载的正品药材，是传统的活血化瘀类动物药。祖国医学文献记载和丰富的临床实践均已证明其具有破血逐瘀、续筋接骨、消炎散结和舒经活血等重要药用功效[1]。现代药理试验也充分证明土鳖虫具有溶解静脉血栓，抑制血小板聚集、抗凝血和抗癌等药效[1]。

土鳖虫体内含有丰富的蛋白质，前期研究证实动物灌胃给予土鳖虫纤溶活性蛋白后凝血时间明显延长，已知蛋白质经胃肠道消化酶的消化作用后吸收进入体内可发挥作用。土鳖虫纤溶活性蛋白的抗凝血作用很可能是消化酶水解产物发挥的作用。因此本实验模拟胃和小肠的环境及消化过程，用胃蛋白酶和胰蛋白酶仿生制备土鳖虫多肽[2]，以明确土鳖虫蛋白入血后发挥抗凝血作用的药效物质基础。同时摸索土鳖虫仿生酶解的最佳工艺，为获得高活性、高得率的土鳖虫多肽和有效利用土鳖虫提供依据。

1 材料与方法

1.1实验材料

土鳖虫干燥体(购自九江市开心人大药房，经九江学院基础医学院高春华教授鉴定为鳖蠊科昆虫地鳖Eupolyphaga sinensis Walker 的雌虫)，APTT、PT试剂(上海太阳生物试剂公司)，胃蛋白酶、胰蛋白酶(Sigma公司)，其它试剂为国产分析纯。

1.2实验方法

1.2.1仿生酶解工艺 该工艺流程参照文献[2]略有改动，取土鳖虫干燥体打粉，过40目筛。称取土鳖虫药材细粉1g于50mL锥形瓶中，加人工胃液( 固液比1∶20)密闭。于37℃恒温水浴作用30min后，按一定量的酶底比加入胃蛋白酶，水解一定时间[3]，然后调节胃蛋白酶酶解液pH至7.0，加入人工肠液20mL ，密闭。于37℃恒温水浴作用30min后，按一定量的酶底比加入胰蛋白酶水解一定时间，然后将酶解液置于85℃恒温水浴作用15min。将各酶解液置于85℃ 恒温水浴作用15min，冷却至室温，以5 000rpm离心10min[3]，取上清液。

1.2.2酶解产物的抗凝作用实验 取健康家兔耳缘静脉注射乌拉坦麻醉后，心脏取血，加入3.8% 枸橼酸钠抗凝(1∶9)，混匀后以3 000rpm离心15min，取上清液，分离出贫血小板血浆(PPP)[4]。

取PPP 100μL于测试杯中，加酶解液10μL，37℃，预温3min，加入APTT或PT 试剂200μL (预温3min)[4]，开始计时，至有纤维蛋白丝出现，准确记录凝固时间，以生理盐水和未酶解土鳖虫为对照。

2 实验结果

2.1胃蛋白酶酶底比考察

随酶底比增大，水解程度逐渐增大，APTT和PT时间也逐渐延长，且均与未酶解和生理盐水组差异有统计学意义，详见表1(p<0.01)。但酶底比为4%和5%的数值差异不大，从节约的角度考虑以4%酶底比为最佳。

表1 胃蛋白酶酶底比考察结果

2.2胃蛋白酶酶解时间

随酶解时间的延长，水解度逐渐增大，APTT和PT时间也逐渐延长，且均与未酶解和生理盐水组差异有统计学意义，详见表2(p<0.01)。但4h和5h的水解度和抗凝效果变化趋于平坦，为节约成本选用4h。

表2 胃蛋白酶酶解时间考察结果

2.3胰蛋白酶酶底比

在最佳胃蛋白酶水解条件水解后，模拟体内水解情况再进行胰蛋白酶水解。表3显示，随酶底比增大，水解程度逐渐增大，APTT和PT时间也逐渐延长，且均与未酶解和生理盐水组差异有统计学意义，详见表3(p<0.01)，虽然水解度一直呈上升趋势，但酶底比为4%和5%的APTT和PT数值差异不大，从抗凝效果考虑，选用4%的酶底比。

表3 胰蛋白酶酶底比考察结果

2.4胰蛋白酶酶解时间

随酶解时间的延长，水解度逐渐增大，APTT和PT时间也逐渐延长，且均与未酶解和生理盐水组差异有统计学意义，详见表4(p<0.01)，但从3h后的水解度和抗凝效果变化趋于平坦，为节约成本选用3h。

表4 胰蛋白酶酶解时间考察结果

综上所述，从抗凝效果来看，随水解时间和酶底比的增大，水解度增大的同时抗凝效果也在增大，但从成本方面考虑，选用胃蛋白酶酶底比为4%、水解4h，胰蛋白酶酶底比为4%、水解3h。

3 讨论

土鳖虫为中药临床常用的动物药，其主要成分为蛋白质，蛋白质为大分子物质，只有经胃肠道消化水解成肽和其它小分子物质后方可被吸收入血发挥作用。因此本实验模拟体内胃肠道的环境[2]，依次经胃蛋白酶和胰蛋白酶进行仿生酶解制备土鳖虫水解产物，以抗凝活性为指标摸索两酶的最佳水解条件。实验结果表明，土鳖虫仿生酶解法获得的土鳖虫水解产物能明显的延长APTT和PT作用时间。凝血是由一系列凝血因子相继酶解激活的过程，包括内源性凝血系统和外源性凝血系统两条途径。APTT和PT分别反映内源性凝血系统和外源性凝血系统的活性[5]，说明土鳖虫水解产物可能是通过内源性凝血途径或外源性凝血途径达到抗凝效果的。

目前土鳖虫多以全粉末直接入药，存在着用药剂量大、易造成微生物污染、可致过敏反应、急性肝肾功能损害、溶血反应、中枢抑制和致畸等毒副作用潜在的危险性[2]。而关于土鳖虫抗凝血作用的药效基础和入血成分还不甚明了。本研究为进一步研究土鳖虫抗凝活性成分奠定了实验基础。

[1]严梦思，李兴暖，赵勇，等. 土鳖虫多肽对正常和免疫抑制小鼠免疫功能的影响[J]. 时珍国医国药，2012，23(8)：1940.

[2]黄能听，王玉蓉，许文博，等. 仿生酶解法提取蜈蚣的工艺研究[J]. 北京中医药大学学报， 2009，51(10)：706.

[3]许文博. 全蝎抗凝活性部位的分离分析及酶解动力学研究[D].北京：北京中医药大学，2010.

[4]黄镇林，曹唯仪，何亮颖，等. 仿生酶解法提取土鳖虫的工艺研究[J]. 中医药信息， 2013，31(2)：20.

[5]李兴暖. 地鳖虫纤溶活性蛋白抗血栓、抗肿瘤及其基因克隆与表达的研究[D].汕头：汕头大学，2007.

(责任编辑胡安娜)

On Bionic Enzymatic Method for Extration of Anticoagulant Activity Eupolyphage Sinensis Walker

WU Xiaoxia， LI Xingnuan， ZHOU Yichun

(School of Basic Medicine of Jiujiang University,Jiujiang,Jiangxi 332005， China)

ObjectiveTo study the condition of bionic enzymatic method of extracting Eupolyphage Sinensis Walker .MethodThe condition of bionic enzymatic method of extracting Eupolyphage Sinensis Walker was observed by single factor observation taken the active partial thromboplastin time (APTT) and prothrombin time (PT).ResultThe best enzymatic hydrolysis condition was as follows: Eupolyphage Sinensis Walker was in artificialgastric juice (37℃) and pepsin (ratio of pepsin to substratewas4% ) for 4 hours， and then was hydrolyzed in artificial intestinal juice (37℃) for 4 hours and trypsin (ratio of pepsin to substrate was 4% ) for 3 hours.ConclusionThe bionic enzymatic method could be used in the extraction of anticoagulant activity Eupolyphage Sinensis Walker

Eupolyphage Sinensis Walker， bionic enzymatic technique， anticoagulant activity

江西省卫生厅科技计划资助项目( 20092078)，九江学院大学生自主创新性实验项目(11XSCXXSY31)

2014-5-1

吴小霞，li_xingnuan@126.com。

R 282

A

1674-9545(2014)03-0075-(03)