直肠癌腹腔镜切除术对机体NK细胞功能的影响*

赖添武 赵权 徐奎 莫志和 林坤娟 黄敏 林世雨

(广西防城港市中医医院 防城港 538021)

直肠癌是常见恶性肿瘤之一，2011年的统计数据显示直肠癌在全球新增恶性肿瘤中排名第二，因其导致的死亡排名第三[1]。随着我国社会的不断进步，人们生活习惯、饮食习惯及环境和遗传因素的影响，直肠癌发病率已明显增加，是继肺癌、胃癌的又一大恶性肿瘤[2]。

外科手术切除病灶仍是可切除直肠癌的首选治疗方式，传统的外科开腹手术在上个40年代已基本发展成熟。上世纪90年代以来，腹腔镜手术技术逐步在各个国家开展，因其创伤小，术后恢复快等优势在各类手术中广泛开展[3]。

目前腹腔镜手术已经成为直肠癌的标准手术方式之一，研究显示对于可切除的直肠癌而言，腹腔镜手术的效果并不亚于开腹手术[4]。免疫系统功能与肿瘤发生、发展、转移和复发都有极为密切的关系。然而，两种不同手术方式对患者免疫系统的影响还存在争议，尤其在恶性肿瘤，机体免疫系统已经十分脆弱的情况下。为评估两种手术方式对患者免疫系统的影响，本研究以外周NK细胞为研究对象，明确腹腔镜手术与开腹手术对NK细胞功能的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象 研究纳入2012年01月至2013年12月在防城港市中医医院收治直肠癌患者45例，随机分为腹腔镜手术组23例，开腹手术组22例，两组患者在性别、年龄、Dukes 分期、平均手术时间上比较，差异无显著性(P>0.05)。见表1。

表1 入组患者的一般资料

1.2 病例诊断标准 ①符合术前纤维结直肠镜和病理活检证实直肠癌者(肿瘤距肛门距离≤10 cm)；②年龄在18～80岁之间；③无严重心、肝、肺、脑、肾等脏器合并症；④无腹部手术史；⑤直肠癌为原发癌灶，不伴其他脏器来源的肿瘤；⑥直肠癌为单一病灶，无多发癌灶或远处转移；⑦既往无恶性肿瘤史者。

1.3 病例排除标准 ①病变已属晚期，手术不能切除或原发灶虽切除，但远处转移病灶无法切除者；②术前、术中，直至术后第6 d接受化疗者；③伴有任何气腹禁忌证者；④急性肠梗阻者；⑤妊娠者；⑥直肠癌灶有浸润者。

1.4 治疗干预手段 两组患者在围手术期处置保持一致，麻醉方式采用气管插管全身麻醉。腹腔镜手术组按常规行4 ～5 孔操作，压力维持在2 kPa。开腹手术组取腹部旁正中或经腹直肌切口，两组患者按直肠癌根治术施行手术。两组患者的不同方式手术均由同一组医生完成。

1.5 研究标本采集 两组患者在术前1 d，术后第3 d，术后第7 d采集外周静脉血5 mL，轻轻混匀，于0～4°C保鲜冰箱暂时放置，随后转入-70℃冻存备检。

1.6 主要仪器和试剂 小鼠抗人单克隆抗体CD16+56+-FITC购自美国BECKMAN COULTER公司，Human NK cell isolation kit 购自德国 Miltenyi Biotec公司，K562细胞株购自中科院上海细胞库。FACS Cabilur流式细胞仪(美国BD公司)，SM-3全自动酶免分析仪(北京天石医疗有限公司)。

1.7 研究指标检测 流式细胞仪检测外周NK细胞：在流式细胞管中加入CD16+56+-FITC 20 μL，并设阴性对照组，再于每管加100 μL 待测样品，常温下避光25～35 min；分别加入溶血素2 mL混匀，上离心机离心10 min，去上清液；加入2 mL PBS混匀，上离心机离心10 min，去上清液；加入5%甲醛500 μL；上流式细胞仪检测。MTT法检测NK细胞杀伤力：参照Human NK cell isolation kit试剂盒说明书分选人外周NK细胞；以K562细胞株作为靶细胞，参照孙卫民的方法[5]计算NK细胞杀伤力。

2 结 果

2.1 NK细胞功能在两组患者术前与术后不同时间点变化情况 经流式细胞仪检测外周NK细胞情况，发现术前两组患者外周NK细胞差异无统计学意义(P>0.05)，然而在术后第3 d和第7 d腹腔镜手术组患者外周NK细胞均比开腹手术组患者明显增多，差异具有统计学意义(P<0.05)，两组患者不同时间点NK细胞杀伤活性差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

组别时间NK细胞(%)NK细胞杀伤活性(%)开腹手术组术前1天15.05±5.9173.51±7.61(n=22)术后3天13.09±4.1472.38±8.11术后7天14.38±4.7274.37±6.77腹腔镜手术组术前1天15.84±5.04△72.98±5.98△(n=23)术后3天15.67±3.39*73.21±6.05△术后7天17.67±4.53*75.08±7.24△

注.△与开腹手术组同时间点比较P>0.05，*与开腹手术组同时间点比较P<0.05

3 讨 论

肿瘤免疫主要以细胞免疫为主，执行细胞免疫功能的细胞主要有杀伤性T细胞、NK细胞和巨噬细胞，以上三种细胞均可直接杀伤靶细胞。NK细胞是一群不同于T、B淋巴细胞的大颗粒淋巴细胞，主要分布于血液及外周淋巴器官，约占人外周血5%～10%的淋巴细胞[6]。NK细胞是先天效应细胞，被誉为天然免疫的核心细胞，在不需要抗原提呈细胞的活化或诱导情况下，NK细胞即可拥有在不损伤正常细胞的前提下杀伤肿瘤细胞的能力[7]。可保护宿主抵御外来细菌、病毒、寄生虫入侵及清除体内肿瘤细胞，起到天然免疫监视作用[8]。NK细胞直接杀伤靶细胞的机制与效应T细胞极为相似，包括穿孔素/颗粒酶途径、Fas与FasL途径和TNFR途径[9]。NK细胞功能状态与肿瘤免疫逃逸关系密切[10]。

腹腔镜直肠癌根治术是一种安全且有效的手术方式，其疗效并不低于传统开腹手术，与开腹手术比较腹腔镜手术创伤明显减少，术后疼痛轻、肠道功能恢复快，住院日短、并发症少。目前，腹腔镜手术已在各大医院广泛开展，然而该手术方式对免疫系统的影响并不明确[11]。腹腔镜手术及开腹手术的创伤均可对患者造成打击，手术创伤诱发的应激状态是免疫损伤的关键。按照常规，术后3天是应激反应的高峰，术后7天可基本恢复到术前水平[12]。研究已经证实开腹手术对免疫系统打击明显，外周CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞明显下降[13]。本研究也证实开腹手术组患者外周NK细胞在术后第3天明显下降，与腹腔镜手术组患者比较，差异具有统计学意义，在术后第7天也得到同样的结果，可见，开腹手术对外周NK细胞有明显影响，而腹腔镜手术影响较小。课题组进一步研究了NK细胞的杀伤活性，发现两组患者不同时间点NK细胞杀伤活性差异无统计学意义(P>0.05)，表明手术方式对NK细胞杀伤活性无影响。

综上所述，腹腔镜手术对患者免疫系统影响小，且对机体创伤少，术后疼痛轻、肠道功能恢复快，住院日短、并发症少，值得广泛开展和推广。

参 考 文 献

[1] Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA:a cancer journal for clinicians,2011,61(2):69-90.

[2] 赫捷,陈万青.中国肿瘤登记年报[M].北京：军事医学科学出版社,2012:21-74.

[3] Seong Dae Lee,Seok-Byung Lim. D3 lymphadenectomy using a medial to lateral approach for curable right-sided colon cancer[J].Int J Colorectal Dis,2009,24:295-300.

[4] Tang CL,EU KW,Tai BC,et al.Randomized clinical trial of the effect of open versus laparoscopically assisted colectomy on systemic immunity in patients with colorectal cancer[J].Br J Surg，2001，88:801-807.

[5] 孙卫民,王慧琴.细胞因子研究方法学[M].北京:人民卫生出版社，2000,108-109.

[6] WhitesideTL，Vujanovic NL，Herberman RB. Natural killer cells and tumor Therapy[J].Curr Top Microbiol Immunol，1998，230:221-244.

[7] Smyth MJ,Hayakawa Y,Takeda K,et al. New aspects of natural-killer-cell surveillance and therapy of cancer[J].Nature Reviews Cancer,2002,2(11):850-861.

[8] LarderLL. Follow the leader: NK cell receptors for classical and nonclassical MHC class I[J].Cell.,1998,92:705-707.

[9] Kayagaki NI，Yamaguchi N，Nakayama M，et al. Expression and function of TNF-related apoptosis-inducing ligand on murine activated NK cells[J].J Immunol,1999, 15(163):1906-1913.

[10] Nosho K, Baba Y, Tanaka N, et al. Tumor-infiltrating T-cell subsets, molecular changes in colorectal cancer, and prognosis: cohort study and literature review [J].The Journal of pathology, 2010,222 (4): 350-366.

[11] Bernard Rudensky, Amos M. Yinnon, et al. The cellular immunological responses of patients undergoing coronary artery bypass grafting compared with those of patients undergoing valve replacement [J].European Journal of Cardio-thoracic Surgery, 2010,37:1056-1062.

[12] Leung KL, Lai PB, Ho RL, et al. Systemic cytokine response after laparoscopicassisted resection of rectosigmoid carcinoma: a prospective randomized trial [J].Ann Surg, 2000,231:506-511.

[13] 程晓文,沈志祥.胃肠道恶性肿瘤患者外周血T细胞亚群检测的临床意义[J].诊断学理论与实践,2005,4 (1):67-68.