BODIPY基荧光传感器对半胱氨酸的检测

黄柳倩，张 晨，张 静，崔 芳，邱化玉，何杏杏，尹守春

(杭州师范大学材料与化学化工学院，浙江 杭州 310036)

前 言

随着社会进步和人类发展，人们对健康问题以及生命领域越来越重视.近几年，含巯基的生物分子由于它们在维持生物系统方面扮演了重要的角色而引起科学家们广泛关注[1].现已证实，细胞中巯基含量的变化会引发许多常见的疾病，例如，癌症、老年痴呆症和心血管疾病等[2].尤其是半胱氨酸的缺乏与很多生理条件相关联，比如，孩子生长缓慢、头发褪色、水肿、嗜睡、肝损伤和皮肤损伤等[3].因此，在生物医疗领域定量检测这些含有巯基的生物分子具有非常重大的意义.

图1 化合物RS1的结构式

4,4-二氟-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省(BODIPY)具有高的荧光量子产率、在可见光区有强的吸收和发射、较好的光学稳定性等优良的光化学物理性能，使得BODIPY可以用于设计合成各种响应性的化学传感器，例如氧化还原型[4]、pH值响应型[5]、化学反应型[6]等.同时BODIPY荧光染料的化学结构易于修饰，这可以使其吸收和发射谱带红移至红外或近红外区[7].在这个波长范围的荧光探针由于减弱了生物体自身的荧光发射和对活细胞的光损伤，因此非常适应于对生物细胞的检测[8].

课题组曾合成了一种基于BODIPY的荧光传感器RS1(如图1)[9].RS1在乙腈溶液中可以选择性地与Hg2+络合，络合后其荧光增强且发生蓝移.由于含巯基的生物分子可以与Hg2+具有良好的络合能力，因此本文将研究RS1-Hg2+络合物对含巯基氨基酸的检测.

1 实验部分

1.1 实验试剂

金属盐Hg(ClO4)2从Aldrich公司购买；光谱级乙腈从Across公司购买.

1.2 实验仪器

目标化合物RS1用1H NMR、13C NMR和ESI-MS等进行详细的结构表征，具体表征数据见参考文献[9].采用Perkin Elmer Lambda 40 UV-可见分光光度计测试紫外可见吸收光谱.采用HITACHI F-2700荧光分光光度计测试稳态发射光谱.

1.3 实验方法

分别配置浓度为2 μmol/L的RS1乙腈溶液、浓度为3 mmol/L的金属汞离子水溶液和半胱氨酸水溶液.然后将20 μL的金属汞离子水溶液滴加到3 mL RS1乙腈溶液中，最后逐滴加入半胱氨酸水溶液，并用紫外和荧光光谱跟踪滴定过程.

2 结果与讨论

2.1 半胱氨酸滴定的紫外-可见吸收光谱

如图2所示，RS1乙腈溶液在550 nm处显示出一个对应于BODIPY生色基团S0→S1跃迁的最大紫外吸收峰.20 μmol/L Hg2+离子加入后，在550 nm处吸收峰显著降低，同时在577 nm处出现一个新的强吸收峰.当加入不同浓度的半胱氨酸(Cys)后，577 nm处的最大吸收峰逐渐降低，而在550 nm处吸收峰逐步增加.当Cys浓度达到40 μmol/L时，此时的紫外吸收与自由的RS1紫外吸收基本一致.这说明由于Hg2+与含巯基的半胱氨酸(Cys)络合能力比与RS1络合能力强，RS1-Hg2+络合物中的Hg2+被Cys夺取而释放RS1.这一过程可以通过肉眼直接观察，20 μmol/L Hg2+离子的加入会导致RS1乙腈溶液的颜色由原来的粉红色变为紫色，而当逐渐加入不同浓度的半胱氨酸(Cys)后，溶液颜色又从紫色逐步变成粉红色.

图2 不同浓度(1, 2, 4, 6, 8, 10,12, 15, 30, 40, 50 μmol/L)Cys存在下，RS1-Hg2+(2 μmol/L) 在CH3CN中的紫外可见吸收光谱

图3 在RS1-Hg2+的CH3CN溶液中(2 μmol/L)加入不同浓度(1, 2, 4, 6, 8, 10,12, 15, 30, 40,50 μmol/L)的Cys荧光发射光谱 (λex = 520 nm)

2.2 半胱氨酸滴定的荧光发射光谱

图3所示的是RS1-Hg2+在不同半胱氨酸(Cys)浓度存在条件下的荧光滴定谱图.当使用激发波长为520 nm激发时，加入20 μmol/L Hg2+金属离子后，594 nm处的荧光发射强度明显增强.然而，随着Cys逐步滴加到RS1-Hg2+络合物中，594 nm处的荧光发射强度逐步降低；当Cys浓度增加到40 μmol/L，RS1-Hg2+的荧光强度降低到自由的RS1荧光发射强度；进一步增加Cys的浓度，荧光强度基本没有变化.未络合的RS1荧光发射很弱，这主要是由于二(2-甲基吡啶)胺基团的氮原子和BODIPY核发生了分子内电荷转移(ICT)过程导致了荧光淬灭.当RS1和Hg2+络合后，胺的供电子性减弱，抑制了ICT过程，从而提高了荧光发射强度.当向RS1-Hg2+体系中加入半胱氨酸(Cys)时，Hg2+与半胱氨酸(Cys)络合释放出RS1，使得荧光强度逐渐降低.

2.3 半胱氨酸的荧光检测极限

向RS1-Hg2+乙腈溶液中不断地滴加半胱氨酸时，随着半胱氨酸浓度的变化，该体系在荧光发射谱图上的荧光强度与半胱氨酸浓度呈现线性变化(如图4所示).因此，利用此线性关系计算得到k=-24.47，根据统计学计算得到浓度标准偏差σ=5.06 μmol/L，再根据公式3σ/|k|我们计算出半胱氨酸的荧光检测极限为0.62 μmol/L(其中σ是标准偏差，k是样品荧光强度对浓度的斜率).这一值低于食品及药物管理局规定在化妆品方面的检测极限(1 μmol/L).因此，RS1-Hg2+络合物可以用于半胱氨酸的检测.

2.4 干扰实验

为了考察其他氨基酸对于半胱氨酸的检测是否有影响，我们做了其他氨基酸对于半胱氨酸检测的干扰实验，即将100 μmol/L的各种氨基酸分别加入到含20 μmol/L半胱氨酸的RS1-Hg2+乙腈溶液中，检测这些氨基酸的加入是否会导致含20 μmol/L半胱氨酸的RS1-Hg2+荧光发射峰强度发生变化.如图5所示，可以看到除了谷胱甘肽(GSH)和苏氨酸(Thr)会导致RS1-Hg2+-Cys的荧光发射强度有20%的增强外，其他氨基酸对于半胱氨酸的检测几乎没有干扰或者很小的干扰.因此，进一步说明RS1-Hg2+络合物可用于对半胱氨酸的检测.

图4 在RS1-Hg2+的CH3CN溶液中(2 μmol/L)加入不同浓度(1, 2, 4, 6, 8, 10,12, 15μmol/L)Cys的荧光发射强度变化(λex = 520 nm)

图5 含20 μmol/L Cys的RS1-Hg2+ (2 μmol/L)乙腈溶液与加入100 μmol/L各种氨基酸的荧光强度对比图

3 结 论

本文利用Hg2+与含巯基的半胱氨酸络合能力比与RS1络合能力强的特点，成功实现了用RS1-Hg2+络合物对半胱氨酸进行检测.RS1-Hg2+络合物对半胱氨酸的荧光检测极限为0.62 μmol/L，低于食品及药物管理局规定的在化妆品方面的检测极限.因此，RS1-Hg2+络合物有望用于在化妆品领域中对半胱氨酸的检测.

参考文献:

[1]Kim S K, Lee D H, Hong J,etal. Chemosensors for pyrophosphate[J]. Accounts of Chemical Research,2009,42(1):23-31.

[2]Seshadri S, Beiser A, Selhub J,etal. Plasma homocysteine as a risk factor for dementia and Alzheimer’s disease[J]. New England Journal of Medicine,2002,346(7):476-483.

[3]Shahrokhian S. Lead phthalocyanine as a selective carrier for preparation of a cysteine-selective electrode[J]. Analytical Chemistry,2001,73(24):5972-5978.

[4]Carmony L H, Erica M W L, Sumit S M,etal. Investigating the Antimalarial Action of 1,2,4-Trioxolanes with Fluorescent Chemical Probes[J]. J Med Chem,2011,54(23):8207-8213.

[5]Alexander N, Andrei Y K, Nienhaus G U,etal. Anthracene-BODIPY Dyads as Fluorescent Sensors for Biocatalytic Diels-Alder Reactions[J]. J Am Chem Soc，2010, 132(8): 2646-2654.

[7]Loudet A, Burgess K. BODIPY dyes and their derivatives: Syntheses and spectroscopic properties[J]. Chem Rev,2007,107(11):4891-4932.

[8]Smith B A, Akers W J, Leevy W M,etal. Optical imaging of mammary and prostate tumors in living animals using a synthetic near infrared Zinc(II)-dipicolylamine probe for anionic cell surfaces[J]. J Am Chem Soc,2010,132(1):67-69.

[9]Huang J L, Ma X W, Liu B,etal. A colorimetric and ratiometric turn-on BODIPY-based fluorescent probe for double-channel detection of Cu2+and Hg2+[J]. Journal of Luminescence,2013,141:130-136.