大岩桐GAI同源基因的克隆及功能研究

费 元,钟 丹 ,韩 雪 ,庞基良

(1.杭州师范大学生命与环境科学学院, 浙江 杭州 310036；2.浙江省绍兴市鲁迅中学分校, 浙江 绍兴 312000)

赤霉素(GA)是一种重要的植物激素，它调节许多植物的生长和发育过程，如种子萌发、叶的生长、根茎的伸长、花的发育以及果实的膨大等[1].赤霉素的信号转导由正向作用因子和反向作用因子调节，GAI基因是GA信号转导途径中的反向作用因子之一，它编码的蛋白属于GRAS家族的DELLA蛋白，DELLA蛋白在GA信号转导途径中发挥着重要作用，赤霉素通过泛素化降解途径促使DELLA蛋白降解，从而引起赤霉素反应基因的表达[2].目前已从拟南芥(Arabidopsisthaliana)、豌豆(Pisumsativum)、杨树(Populusalba)苹果(Maluspumila)、葡萄(Vitisvinifera)[3-7]等多个物种中克隆到GAI的同源基因.GAI的功能缺失会产生拟南芥突变体ga1-3 迟开花的表型，说明GAI起抑制花转变的作用[8].拟南芥的GAI基因在水稻中过表达会引起植株的矮化，而这可能会产生一系列的水稻高产品种[9].葡萄的VvGAI突变会引起在原本形成卷须的部位产生花序[10].VvGAI还与葡萄的育性、串重、果实品质相关[11].以上研究表明GAI基因与株高、花芽分化以及果实发育密切相关.

我们通过在培养基中添加赤霉素和细胞分裂素，建立了离体培养大岩桐花被切块高频率直接再生花芽的实验体系[12-13].GAI基因既是GA信号转导的反向作用因子，又在花发育中起作用，本研究克隆了大岩桐的GAI同源基因，并通过农杆菌介导法转化烟草，初步研究了大岩桐GAI同源基因的功能.

1 材料与方法

1.1 供试材料

本实验所用的大岩桐(Sinningiaspeciosa)，种植于杭州师范大学玻璃温室.取新鲜花蕾分装，于液氮中保存备用.

1.2 方 法

1.2.1 总RNA的提取与cDNA合成

采用异硫氰酸胍法(GT)提取花蕾(直径约5 mm)组织的总RNA，取2 μg RNA，使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(ToYoBo，Code：FSK-100)合成cDNA.

1.2.2 GAI基因保守区克隆

通过对已经在GenBank上发布的拟南芥等植物GAI同源基因序列的比对，在其保守区域设计一对引物，Della 004：5’-CAC GCC ACC ACG TTGCAG AT-3’ ，Della 005：5’ -GCACTT CTA CGA GAC CTG CC -3’ ，以反转录后的大岩桐cDNA为模板进行PCR，PCR的条件是94 ℃ 3 min，94 ℃45 s，55 ℃45 s，72 ℃1.5 min，72 ℃10 min ，30个循环.将该PCR扩增产物经1.2%琼脂糖电泳后，利用DNA 胶回收试剂盒回收，连接到pMD18-T 测序载体，送上海生工公司测序.

1.2.3 3’端的克隆

根据测序得到的GAI保守区序列，在序列内部设计两个5’端巢式引物与试剂盒所带引物形成嵌套，以第一链cDNA为模版进行3’RACE.两个5’端的引物Della 007(Outer): 5’ -TTT GGT ATG AAA CAG GGA ATG C -3’；Della 008(Inner): 5’- CAA GCA TTG GCG TTG AGG C -3’.试剂盒所带引物：3RACE(Outer)：5’ - TAC CGT CGT TCC ACT AGT GAT TT -3’；3RACE(Inner)：5’- CGC GGA TCC TCC ACT AGT GAT TTC ACT ATA GG -3’.

1.2.4 5’端的克隆

根据已知的中间序列，设计两个3’端巢式引物与试剂盒所带引物形成嵌套.以第一链cDNA 为模板按照试剂盒方法进行5’RACE，将PCR 扩增产物回收后，连接到pMD18-T测序载体后，送上海生工公司测序.两个3’端巢式引物是Della 012(Outer)：5’ -TCC AAT GAA ACG AAA AGG GTC -3’；Della 010(Inner)：5’ -CCA CCG TCT CAC CTT CCC TAA -3’.试剂盒所带引物5RACE(Outer)：5’ -CAT GGC TAC ATG CTG ACA GCC TA -3’；5RACE(Inner)：5’ -CGC GGA TCC ACA GCC TAC TGA TGA TCA GTC GAT G -3’.

1.2.5 GAI基因全长的克隆

用DNAstar 软件拼接所得的3 段序列(中间序列、3’端序列和5’端序列)，根据拼接结果，在两端设计基因的特异性引物，全长引物是SsGAI001：5’ -CGG GAT CCT TTC AAG AAA ATG AAG AGA GAC CAC -3’; SsGAI002：5’ -CGA GCT CCA AAC CAG ACC GGG TTT CAC TC-3’，进行全长PCR 扩增，将PCR 扩增产物回收后，连接到pMD18-T 测序载体后，送上海生工公司测序.

1.2.6 生物信息学分析

将测序结果通过NCBI 网站进行核苷酸序列比对(Blastn)和氨基酸序列比对(Blastp)；用DNAman 4.0 进行氨基酸序列比对分析；根据同源比对结果，用MEGA 4.1 进行进化树分析.

1.2.7 SsGAI器官特异性表达分析

由图6可知，当传输距离为1 km时，随着能见度的增加，三种辐射波在平流雾和辐射雾中的透过率均逐渐增加，且在相同的辐射波和能见度下，平流雾的衰减均大于辐射雾的衰减.相同能见度下三种辐射波衰减程度由小到大排序，在平流雾中依次是10.6 μm、1.064 μm和3.8 μm，在辐射雾中依次是10.6 μm、3.8 μm和1.064 μm.

分别提取大岩桐的根、茎、叶、花萼和直径5mm花芽的总RNA，反转录后得到不同组织的cDNA，以肌动蛋白(Actin)作为内标对cDNA模板进行半定量，通过对不同的cDNA模板进行RT-PCR，确定SsGAI在不同组织中的表达量.PCR 反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，扩增30 个循环；72℃延伸10 min.Actin 的引物为ActinF：5’-GGAGAAGATCTGGCATCACA-3’，ActinR：5’-CCTCCAATAAAGACACTGTA-3’.

1.2.8 SsGAI的载体构建和烟草转化

以pBI121为基础，CaMV 35S为启动子，构建SsGAI同源基因全长ORF序列的超表达载体.用BamHI和SacI对克隆载体pMD18-T Simple进行双酶切，所得ORF连接到用相同内切酶进行双酶切的pBI121载体上，取代GUS基因，获得pBI121-SsGAI表达载体.将重组质粒转化大肠杆菌XL1-Blue.构建过程中质粒DNA 小量提取、酶切、片段回收均参照试剂盒(上海生工公司产品)说明书进行.

使用冻融法(参考分子克隆实验指南第2版)将pBIN19-35S-SsGAI表达载体导入根癌农杆菌GV3101 中，用叶盘法转化烟草(品种为“黄苗鱼”)，在含80 μg · mL-1卡那霉素的MS 培养基上筛选幼苗，转基因阳性苗经过炼苗后，移栽至花盆中，栽培基质为泥炭∶珍珠岩=3∶1，培养在人工气候室，24 ℃，12 h/18 ℃，12 h.

转基因烟草苗(T0 代)移栽30 d 后，对9株转基因烟草的叶片进行了SsGAI的RT-PCR 分析.并于转基因烟草苗移栽75 d 后，仔细观察各种花器官的形态变化.

2 结果与分析

2.1 SsGAI 基因的序列

根据GAI保守序列设计引物，以大岩桐花蕾cDNA为模板，经PCR扩增获得一条608bp的特异片段，用RACE法分别获得3’端1150bp和5’端1256bp的目的片段.将已得到的三段序列通过DNAman软件进行拼接，根据拼接序列在ORF两端设计引物进行PCR扩增，获得SsGAI的全长ORF序列，长度为1689 bp.

2.2 SsGAI 全长序列生物信息学分析

通过序列拼接得到SsGAI的全长序列.SsGAI的cDNA全长为2147 bp，该序列包含一个完整的开放阅读框(ORF)，长度为1689 bp，编码562个氨基酸，起始密码子为ATG，在序列的5’端17-18核苷酸处可能有一段信号肽剪切位点，含有加尾信号AATAA1-3序列和poly(A)11序列(图1).该序列的GenBank登录号为FJ594773.Blastp分析发现，SsGAI与葡萄的VvGAI及陆地棉的GhGAI相似性分别为68%、64%.

图1 大岩桐SsGAI基因全长序列和推测的氨基酸序列

2.3 SsGAI 氨基酸序列的系统进化分析

在软件MEGA 4.1平台上构建系统进化树，对SsGAI基因编码的氨基酸与GenBank记载的13种GAI蛋白之间构建系统进化树，进行聚类分析.图3结果显示：SsGAI与葡萄的VvGAI及陆地棉的GhGAI相似性分别为68%、64%.大岩桐SsGAI归属于GRAS家族中的双子叶家族的分类群，而与单子叶植物亲缘关系较远.

2.4 SsGAI基因的器官特异性表达分析

如图4所示，以大岩桐Actin为内参，SsGAI在叶、花萼、直径5 mm的花芽、根中都有表达，且在花萼中表达量较高，但是在茎中表达沉默.

图2 大岩桐及其他植物GAI氨基酸序列同源性比对

注：系统发育树分析及多序列比对所涉及到的有关基因序列如下：大岩桐的SsGAI(ACM47244.1)；杜梨的pbGAI(AFJ23219.1); 苹果的mdGAI(ADW85805.1)；玫瑰的RoGAI(AGK07287.1);陆地棉的GhGAI(ACR58455.1)；毛白杨的PtGAI(AFP58844.1)； 海岛棉的GbGAI(ABG26370.1)；胡桃的JrGAI(AEE69074.2)；莴苣的LsGAI(BAG71200.1)；蓖麻的RcGAI(XP_002527794.1)； 猕猴桃的AdGAI(AHB17742.1)；可可的TcGAI(XP_007045197.1)；葡萄的VvGAI(AEK06229.1)

2.5 转SsGAI烟草的表型分析

利用农杆菌介导法将SsGAI基因转化烟草，在转基因苗移栽30 d后，对转基因烟草叶片进行了SsGAI表达的RT-PCR检测分析.结果显示，在转基因烟草中检测到了SsGAI的表达，野生型中未检测到SsGAI的表达(见图5)，说明SsGAI已整合进烟草基因组，并成功表达.

注：L：叶；S：花萼；F：直径5mm花芽；R：根；ST：茎

注： M: MarkerⅢ; 1-9：转化植物；10:野生型植株

转基因烟草移栽75d后开始观察并记录其表型变化，野生型烟草的花有5个花瓣，转SsGAI烟草的花表现出了两种新的表型：1)6瓣花，出现频率为18.06%；2) 8瓣花，出现频率为30.56%(表1).且转基因烟草的植株高度显著下降，花期延迟(见图6).

表1 移栽后转基因烟草的花型及株形变化

A.转化SsGAI和野生型的烟草植株，a为转化SsGAI的植株；b为野生型植株；B．野生型的开放花，花瓣5枚；C. 转SsGAI 的开放花，花瓣6枚；D. 转SsGAI 的开放花，花瓣8枚.

3 结 语

DELLA蛋白作为GA信号转导的主要反向作用因子，起着调节植物生长和发育过程的作用. 本研究克隆了大岩桐SsGAI基因，并利用生物信息学对SsGAI进行了系统分析.SsGAI基因推导的蛋白序列与其他植物有一定差异，但均含有保守的DELLA结构域，且N端都含有酶活性中心区域TVHYNP，表明在进化中基因功能结构域的稳定性.大岩桐SsGAI编码的多肽链无信号肽酶切位点，表明SsGAI在细胞中合成后，不进行蛋白转运，其在细胞内的准确定位还有待研究.

SsGAI在根、叶、花萼、花芽中都有表达，但是在茎中表达沉默，推测该基因可能在各个器官中发挥着不同的调节作用.

SsGAI转化烟草植株株型矮化，花瓣数量增加，这表现为GA缺失的表型,这可能是DELLA蛋白的过量表达使其抑制功能进一步加强，抑制了赤霉素的作用，使植株矮化、节间变短和花发育发生异常等.Hani等[14]将一个拟南芥GAI基因转化烟草，结果发现转基因植株也表现花瓣数增加，此外还有雄蕊花瓣化现象发生.Llewelyn等[15]将35S：GAI转入烟草，转基因植株矮化，花和果荚发育异常.在番茄中过量表达苹果Mhgai1，会表现出花器官变小和单性结实的性状[16].

综上所述，本研究克隆得到了大岩桐SsGAI基因的全长cDNA，并对该基因序列，其编码的氨基酸序列、功能结构域及在器官中的表达区域等进行了初步分析，并将其置于烟草中异位表达，进一步研究了它对植物生长发育的影响.

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