EBV-DNA拷贝数和EBERs原位表达在鼻NK/T细胞淋巴瘤诊断中的一致性研究

邓玲 邵建永 张旭 汤涛 邵琼 李银珍

NK/T细胞淋巴瘤(NKTCL)于2001年WHO正式纳入恶性淋巴瘤的病理新分型，属于结外非霍奇金淋巴瘤中一种独立的临床病理疾病，主要分为鼻NKTCL和结外鼻型NKTCL[1]。鼻NKTCL因绝大部分好发于鼻腔而得名。此型淋巴瘤具有独特的免疫表型、特殊的组织形态以及生物学行为，其发病具有地域特色，亚洲地区为高发区，大部分集中在中国南部，罕见于欧美国家。其临床进展快，具有高度侵袭性，临床预后差。在临床病理诊断中，由于组织中有大量的炎症细胞浸润、大片坏死以及不典型增生常常导致误诊和(或)诊断延迟[2]。为提高鼻NKTCL的诊断率，本研究针对我院诊断的50例鼻腔NKTCL的临床资料回顾性分析，并采用免疫组织化学技术检测相关抗原的表达，实时定量PCR检测EBV-DNA 拷贝数以及原位杂交技术检测EBV编码的RNA。综合组织形态学，分子标记物表达情况，提高我们对本病的认识。

材料与方法

一、材 料

收集我院2010年1月至2011年10月诊治的鼻NKTCL 50例。其中男40例，女10例，年龄12～72岁，中位年龄49岁。所有标本均用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，HE染色，经免疫组织化学检测CD3, CD45RO, CD20, CD56, CD79a，TIA1，Granzyme B确定肿瘤细胞的免疫表型(由病理科技术员完成)。根据2001年WHO关于淋巴造血组织肿瘤分类鼻NK/T细胞淋巴瘤的诊断标准，依据组织形态学、临床特征以及上述提及的免疫组织化学结果，由经验丰富的2位病理医生共同诊断为鼻NKTCL。

二、免疫组织化学

常规石蜡切片，4～5 μm。切片脱蜡至水。pH 8.0的EDTA 高压抗原修复后至室温冷却。3%过氧化氢封闭10 min以降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色。依次滴加不同的抗体，包括CD3, CD45RO, CD20, CD56, CD79a，TIA1，Granzyme B，放置于37℃温箱40 min。PBS 缓冲液洗2 min，共3次。滴加DAKO二抗，温箱30 min。DAB 显色，于显微镜下观察。

三、实时定量PCR检测EBV-DNA拷贝数

①基因组DNA提取：石蜡标本5 μm切片10张置于干燥离心管，应用QIAGEN公司石蜡组织基因DNA提取纯化试剂盒从石蜡组织中提取基因组DNA(具体操作步骤见试剂盒说明书)，将提取的基因组DNA进行EBV-DNA检测。EBV上游引物：AATTTTTTCTGCTAAGCCCAACA；下游引物：ACGGGTGGGTGTGTGTAGTGT；探针: FCCACCACACCCAGGCP。②实时荧光定量PCR检测：荧光定量PCR原理，参考文献[3]。采用Taqman技术，利用实时荧光定量PCR方法对EBV-DNA浓度进行检测，总反应体系为15 μl，其中包括模板DNA 2 μl，反应混合液13 μl (含ABI Universal master MixⅡ、检测引物及特异位点探针、H2O)，每次反应均设置阳性及阴性对照。荧光定量PCR仪型号为ABI 7500。PCR反应条件分别为：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 30 s，55℃ 45 s，共50个循环。③结果：PCR扩增结果用自动分析软件Sequence Detection System software (Version 2.0)进行自动分析(美国ABI公司)。每批PCR反应用双蒸水作为阴性对照，克隆合成的EB病毒W片段作为阳性对照，并稀释成不同的浓度梯度(107，106，105, 104,103, 102拷贝/μl)，其相关系数R2=0.99，绘制成定量标准曲线，进行PCR反应。

四、原位杂交检测地高辛标记EBV编码的小RNA(EBERs)的表达

对NK/TCL石蜡组织进行EBERs原位杂交，计算阳性细胞数占总肿瘤细胞的的百分比。原位杂交所用的试剂盒购买于北京中杉金桥公司。实验步骤如下：组织切片脱蜡水化，胃蛋白酶于室温下消化15 min，EBERs探针37℃杂交，杂交完成后，滴加链接有辣根过氧化物酶的抗地高辛抗体，37℃ 45 min。DAB显色，苏木素复染，封片，显微镜下观察。

五、统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件包进行统计分析。相关性分析用Spearman等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、鼻NKTCL患者临床表现、病理形态学及EBERs原位杂交检测

50例中几乎所有患者发生鼻出血、坏死以及溃疡100% (50/50)， 部分患者伴有消瘦、盗汗。由于广泛的鼻部坏死，出现鼻、口腔分泌物恶臭，这是一个非常特异的临床表现。鼻NKTCL多有凝固性坏死表现，因此病理形态学常表现为肿瘤性淋巴细胞弥漫或散在分布，肿瘤细胞大小不等，核深染，不规则，染色质边集，细胞核多呈泡状，核仁不明显或有小核仁，核分裂易见(图1A)。肿瘤细胞浸润破坏血管壁及病灶内反应性炎细胞浸润。免疫组织化学标记物CD3、CD56、TIA1、Granzyme B均为阳性(图1B、C、D、E)。对50例鼻NKTCL患者的石蜡组织做原位杂交检测EBERs表达(图1F)，结果所有的病例均为阳性，阳性表达率达100%。鼻NKTCL EBERs原位杂交阳性细胞数占总细胞数的百分比(中位分值为53%)，与相应患者的对应的石蜡组织的EBV-DNA定量检测水平有显著性相关性(Spearman 检验：rs=0.609,P<0.01)。

二、鼻NKTCL患者组织EBV-DNA实时定量PCR检测

荧光定量PCR标准曲线的建立见图2A、B。实时定量PCR检测50例NKTCL患者的石蜡组织中EBV-DNA的水平(图2C)，其检出率为100%(50/50)。而且，所有患者的EBV-DNA拷贝数均处于一个较高的水平，最小拷贝数为127.105，最大拷贝数为1 450 000，其中位拷贝数是23 750。

图1 鼻NKTCL病理形态学表现及原位杂交检测EBERs表达

图2 荧光定量PCR曲线

讨 论

NKTCL是组织形态学复杂，需经典型临床表现、免疫组织化学及分子生物学技术证实的恶性淋巴瘤[4]。主要发生在鼻部淋巴结外。其瘤细胞大部分来源于外周NK细胞，少部分来自NK/T细胞。

NKTCL的诊断主要是依据组织形态学、免疫组织化学。此型淋巴瘤具有非常特异的组织学表达。如大片样坏死，侵犯血管，形成洋葱样结构。本研究中的50例组织形态学典型，大量坏死、出血以及溃疡的改变。其形态学的改变符合NKTCL组织学特征。免疫组织化学标记物CD3、CD56、TIA1、Granzyme B阳性是NKTCL的诊断依据[5]。纳入本次研究的50例鼻NKTCL患者的上述标记物均为阳性。

大多数患者表现为EBV阳性表达，在我国患病人群中特别南方地区的EBV感染率是非常高的。免疫功能缺陷或紊乱，长期抗原刺激导致淋巴细胞异常增殖是本病的发病因素。这些研究结果均提示EBV是致病因子或者说是起到了病原学的作用[6]。有研究表明，高达75%～100%的瘤细胞表达EBV相关基因。本研究检测的鼻NKTCL患者中的EBV-DNA 阳性率达到100%(50/50)。EBV-DNA对诊断NKTCL具有非常重要的参考价值。

目前，EBV编码的EBERs已经作为一种分子标记物用于检测组织中的EBV[7]。本研究分别采用实时定量PCR检测EBV-DNA和原位杂交技术检测EBERs。NKTCL均是阳性的，而且EBV-DNA水平和EBERs的表达水平有显著性正相关，这就提示NKTCL中有EBV的整合。表明EBV相关抗原与基因与鼻NKTCL密切相关[8]。

综上所述，石蜡组织中的EBV-DNA拷贝数和EBERs 的原位表达具有高度一致性。为临床实验工作者提供两种不同的实验方法，可根据自己所在的实验室条件酌情选择。

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