不同产地蒺藜药材中氨基酸成分比较分析

2014-08-15纪思宇李瑞海贾天柱

实用药物与临床 2014年2期

纪思宇，申枢，李瑞海，贾天柱，王东

0 引言

蒺藜为蒺藜科蒺藜属植物蒺藜(TribulusterrestrisL.)的干燥成熟果实，性微温，味辛苦，有小毒。入肝、肺经，具有平肝解郁、活血祛风、明目止痒的功效[1]。用于“头痛眩晕、胸肋胀痛、乳闭乳痈、目赤翳障、风疹瘙痒”[2]。其果实始载于《神农本草经》，列为上品[3]。本试验收集不同产地的18份蒺藜商品药材，对其中的氨基酸成分的种类与含量进行测定并分析比较，以期为蒺藜药材质量评价提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 P230II大连依利特氨基酸自动分析仪；UV230II紫外检测器(大连依利特公司)；ALC-110.4电子分析天平(北京赛多利斯特仪器系统有限公司)；HH-4数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；SF-130B高速粉碎仪器机(上海冠联制药装备有限公司)；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 试药与材料 18种氨基酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：20100108)，衍生化试剂(2，4-二硝基氟苯，大连依利特公司提供)。乙腈为色谱纯；冰醋酸、N,N-二甲基酰胺为分析纯；水为纯净水。蒺藜药材产地：1江西樟树、2山西、3安徽亳州、4福州、5安徽、6贵阳、7陕西、8江西、9河北安国、10内蒙、11河南购于黑龙江鸡西、12河南购于湖南、13赤峰、14内蒙、15河南购于辽宁本溪、16河北购于广东、17内蒙、18河北。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm，大连依利特)，柱温：27 ℃；检测波长360 nm；流速1.2 mL/min，梯度洗脱，洗脱曲线设定为，时间(A相百分比例%)：0(16)、0.3(16)、4(31)、9.5(36)、17(55)、28(65)、34(100)、36(100)、38(16)。

2.2 流动相的配制 A相：乙腈-水(1:1)；B相：固体组分 B 4.1 g，加水950 mL，冰醋酸调pH值至6.4～6.8，加10 mL N,N-二甲基甲酰胺，加水定容至1 000 mL量瓶中，摇匀后过滤，备用。

2.3 衍生缓冲溶液的配制取衍生缓冲溶液固体组分A 1.24 g；固体组分B 7.63 g，加水定容至500 mL量瓶中，摇匀，备用。

2.4 平衡缓冲溶液的配制取平衡缓冲溶液固体组分A 0.91 g；固体组分B 3.58 g，加水定容至250 mL量瓶中，摇匀，备用。

2.5 对照品溶液的制备氨基酸对照品适量(丙氨酸5.1 mg，组氨酸5.0 mg，脯氨酸4.9 mg，精氨酸5.3 mg，亮氨酸5.6 mg，丝氨酸4.8 mg，天门冬氨酸5.3 mg，异亮氨酸4.8 mg，苏氨酸5.0 mg，半胱氨酸5.0 mg，赖氨酸5.0 mg，色氨酸5.1 mg，谷氨酸5.0 mg，蛋氨酸4.9 mg，缬氨酸4.9 mg，甘氨酸4.9 mg，苯丙氨酸5.6 mg，酪氨酸2.7 mg)。精密称取，加衍生缓冲溶液定容至250 mL容量瓶中，备用。

2.6 供试品溶液的制备取样品粉末0.1 g，精密称定，置具塞试管中，加6 mol/L盐酸溶液3 mL[5]，混匀，置烘箱，于110 ℃中水解24 h。水解后，样品多次用水洗涤，从具塞试管转入蒸发皿中，80 ℃水浴加热蒸干。衍生缓冲溶液多次洗涤蒸发皿，转入25 mL容量瓶中，用衍生缓冲溶液定容，混匀，0.45 μm微孔滤膜过滤。取已过滤的样品液2 mL置于10 mL棕色容量瓶中，加入衍生化试剂1 mL，放入60 ℃水浴中暗处反应1 h，取出冷却至室温，加平衡缓冲溶液定容至刻度，静置15 min，0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。

2.7 标准曲线的绘制取“2.5”项下对照品溶液0.3、0.7、1.1、1.5、1.9 mL，分别置于10 mL棕色容量瓶中，分别加入衍生化试剂0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，按“2.6”下方法制备。进样量为20 μL，按照“2.1”项下色谱条件，进样测定，以各个氨基酸对照品溶液的进样量为横坐标X(μg)、相应的峰面积值为纵坐标Y，绘制标准曲线，各个氨基酸的回归方程及线性范围见表1。

表1 各氨基酸成分的回归方程及线性范围

2.8 方法学考察

2.8.1 精密度试验取对照品溶液，按“2.1”色谱条件，连续进样6次测定，各峰面积的RSD均≤1.94%，表明精密度良好。

2.8.2 重现性试验取样品6份适量(过40目筛，每份约100 mg)，精密称定，按“2.6”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样测定，各色谱峰的相对峰面积的RSD≤2.0%，表明此方法具有良好的重现性。

2.8.3 稳定性试验取13号供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，于2、4、8、10、12、24 h进样测定，各色谱峰的相对峰面积的RSD均≤1.98%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8.4 加样回收率试验分别取已知含量的3号样品6份粉末适量(过40目筛，每份约50 mg)，精密称定，并分别精密加“2.5”项下对照品溶液适量，按“2.6”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，进样测定，计算加样回收率的RSD均≤1.85%。

2.9 含量测定分别精密吸取各供试品溶液5 μL，按“2.1”项色谱条件，进样测定，依据标准曲线回归方程，计算各氨基酸的含量见表2。

表2 蒺藜药材中氨基酸种类与含量(mg/g，产地1～9)

注：*为人体必需氨基酸，T为氨基酸总量，E为必需氨基酸总量，下同

3 讨论

本试验采用柱前衍生反相高效液相色谱法[6]，即先将氨基酸转化成衍生物，再进行色谱分离的一种衍生方法，可在12～40 min短时间内分离出18～26种氨基酸[7]，其通用性强，具有良好的选择性，分离度较高，灵敏度及精密度良好，随着氨基酸研究的不断深入，柱前衍生化法逐渐地成为氨基酸成分分析测定的一种主要方式。目前，关于蒺藜中皂苷类成分研究的文献报道较多，而蒺藜仁中氨基酸的种类及含量未见报道，只对蒺藜仁中游离氨基酸的总含量有所报道[8]。本试验采用此方法测定不同产地蒺藜中氨基酸的含量，并比较其差异性，确定了一种可行的蒺藜氨基酸测定方法。

由本研究可知，在18个不同产地的蒺藜药材中，均含有所检测的18种氨基酸，说明蒺藜药材所含氨基酸种类较为丰富。其中包括8种人体必需氨基酸。人体必需氨基酸是生命代谢的必需物质，缺乏必需氨基酸易导致缺乏活力和精力、早衰、伤口愈合性差、儿童发育迟缓等症状。