不同宿主来源的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分子流行病学研究进展

苏 洋，陈智华，邓海平，李春慧，蒲万霞*

(1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 农业部兽用药物创制重点实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃 兰州 730050；2.甘肃农业大学 动物医学学院，甘肃 兰州 730070)

耐甲氧西林金黄色葡萄球(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)是医院内和社区内获得性感染的主要病原菌，也引起动物疾病的发生，而且健康人群的携带率为20 %～30 %[1]，其携带的mecA 耐药基因编码与β-内酰胺类抗生素亲和力极低的PBP2a 蛋白而导致菌株的耐药。自1940 年青霉素被用于治疗因金黄色葡萄球菌(S.aureus)引起的感染后，很快便出现了耐药菌株；1959年，半合成青霉素-甲氧西林首次被用于治疗耐青霉素的S.aureus 后，1961 年既有MRSA 的报道。在随后的几十年中其耐药菌株在世界范围内不断地出现，由于其高度耐药性和异质性给临床治疗带来了极大的困难。美国每年因感染MRSA 而导致的死亡人数已超过艾滋病，我国MRSA的感染率达到了33.3 %～80.4 %。MRSA 的感染已经成为研究的热点，许多学者将MRSA 的感染同艾滋、乙型肝炎列为世界范围内最难解决的3 大感染性疾病。近年来，越来越多不同动物源性MRSA 的出现，给兽医临床和公共卫生安全带来极大的威胁。本文就近年来国内外对MRSA 的分型方法及其在动物种的流行情况作一综述。

1 分型方法

1.1 脉冲场凝胶电泳分型方法(PFGE)PFGE 是上世纪80 年代Schwartz 和Cantor 等建立的，可以用来分离整条染色体这样超大分子量的细菌DNA，被认为是鉴定S.aureus的“金标准”。MRSA 在溶菌酶和溶葡萄球菌素的作用下获得完整DNA，并通过核酸限制性内切酶SmaⅠ或CspⅠ消化后可获得10～20 个长约10 kb～700 kb 的DNA 片段。DNA 片段经PFGE 分离，根据Tenover 等提出的标准[2]分为：①相同(Indistinguishable)：酶切图谱间具有同样的条带数，而且相应条带大小相同，流行病学上则认为相同，可认为是同一型别；②紧密相关(Closely related)：由点突变、插入或缺失DNA 等导致的2～3 个差异条带，很有可能是同一型别，定为亚型；③可能相关(Possibly related)：两个独立的基因变件可能引起4～6 个条带的差异，也许是同一型别，可定为亚型；④不相关(Different)：3 个或更多独立基因变异所致7 个或以上的差异条带，可认为在流行病学上不相关性。

1.2 多位点序列分型(MLST)该方法是在多位点酶凝胶电泳(MLEE)基础之上改进而来，S.aureus 的MLST 分型研究选择arC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqil 7 个看家基因，PCR 扩增、测序及序列比对，将测序结果与相应基因的标准序列进行比对并截为标准长度，提交数据库(http://www.mlst.net)获得每株菌株各个位点的等位基因号，并由每株细菌7 个看家基因的等位基因号再获得序列号(Sequence typing，STs)[3]。

1.3 SCC mec分型 该方法是根据SCC mec 染色体盒的组成元件不同为基础，包括mec 基因复合体、ccr 基因复合体及mec 和ccr 基因复合体之外的J 非编码区。由于SCC mec 染色体盒携带不同的基因元件，到目前它已经被鉴定出SCC mec Ⅰ～Ⅺ共11 型(IWG-SCC)，而其中的SCC mecⅣ由于J 区的不同又被分为Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc、Ⅳd、Ⅳg、Ⅳh、Ⅳi、Ⅳj 8 个亚型[4]。近年来SCC mec 已建立起多种分型方法，但广泛使用的是Zhang 等建立的多重PCR 方法，该方法能同时检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc、Ⅳd 及Ⅴ8 个型[5]。

1.4 spa基因分型 Spa 蛋白是位于S.aureus 细胞壁的一种蛋白成分，具有种、属特异性而无型的特异性。spa 分型仅涉及到spa 基因序列，该基因长约2 150 bp，包括Fc结合区、X 域和C 末端3 个区域。其中X 域含2～15 个长约21 bp～27 bp 的重复序列，该区域由于重复序列的数目、特征及排列顺序不同具有高度多态性。根据spa 基因的高度重复可变序列设计引物对X 区域进行扩增，将PCR 产物测序后与数据库中已有的型别比对。目前，已经建立了spa 重复序列和分型数据库(http://spa.ridom.de)，已有重复序列563 个、基因型11 372 个。

2 MRSA与寄主的关系

为研究不同宿主来源MRSA 的分子流行病学情况，对其进行SCC mec、spa、MLST 及PFGE 等分型研究结果表明，某些菌株具有较强的宿主特异性，但这种特异性又在某些菌株中并非是绝对的。如，目前所知的几种人源性流行菌株ST5-MRSA-Ⅰ、ST5-MRSA-Ⅱ、ST5-MRSA-Ⅲ、ST5-MRSA-Ⅳ、ST8-MRSA-Ⅰ、ST-MRSA-Ⅱ、ST8-MRSA-Ⅲ、ST8-MRSA-Ⅳ、ST22-MRSA-Ⅳ、ST30-MRSA-Ⅳ、ST45-MRSA-Ⅱ及ST45-MRSA-Ⅳ等未在动物中发现，并且具有地理性分布特点[6-7]。但某些MRSA 既能感染人类又能感染不同动物，如ST22-MRSA-ⅣMRSA 在人类、猪和马中都曾被发现[8]；此外，最初与猪感染最为密切的ST398 LA-MRSA，后来发现它同样感染奶牛、家禽、犬及马[8]，在欧洲部分地区流行的奶牛乳房炎MRSA 的MLST 分型主要为ST398[9]。研究表明生活在养猪场附近人群中所携带的MRSA 属于ST398 家系[10-11]。荷兰12 %人源性MRSA 为ST398 型，而1.7 %人源性MRSA 在8个欧洲国家也检测为ST398[12]。Sergio 等首次从亚洲地区的养猪场和工人上分离到ST398 LA-MRSA 菌株[13]。这表明部分MRSA 的宿主特异性并非是绝对的，有着更大的感染范围。

3 MRSA在动物中的流行情况

3.1 MRSA在宠物中的流行情况 在社区获得性MRSA(CA-MRSA)流行加剧的情况下，驯养动物特别是与人类接触最为密切的宠物不可避免的暴露于MRSA 中，而宠物中的MRSA 又将给其它动物和人类健康带来严重的威胁。在英国，首次从宠物中分离出MRSA，研究表明这些菌株属于ST22，推测可能来源于人类。医院内获得性MRSA(HA-MRSA)和CA-MRSA 也从犬中分离到，这与其犬主人有关[14]。因此，推测宠物感染或定植MRSA 与其主人、临床兽医师及兽医外科手术有关。犬与携带MRSA的人类或其它动物接触后，自身便成为MRSA 的寄主，只是不表现出临床症状，在创伤或术后可能会导致MRSA的机会性感染。

3.2 MRSA在家畜中的流行

3.2.1 MRSA 在猪中的流行 引起人们关注动物源性MRSA 是源于荷兰某养猪场的意外发现，其饲养员MRSA的携带率是荷兰普通国民的760 倍，并且这些菌株主要是MLST ST398 MRSA。此后，ST398 MRSA 在新西兰、丹麦、德国、葡萄牙、加拿大和美国等地区的养猪场检出。起初ST398 LA-MRSA 的报道仅见于欧洲等国，但最近也在亚洲国家的养猪场分离到ST398 LA-MRSA。虽然ST398 在猪中的检出率很高，但它毒力不强，临床致病性感染鲜有报道。此外，其它MRSA 也在猪中发现，一种普遍为人所感染的USA100 菌株也从猪群中分离到，这可能是从人类传给猪的[15]；ST9 MRSA 首次从四川双流地区的养猪场分离到[16]；ST9、ST912 及ST1297 MRSA 也从中国部分地区的养猪场和猪场员工中分离到[17]。表明不同MRSA 可感染或定植于猪群中。

3.2.2 MRSA 在奶牛中的流行 S.aureus 是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一，而牛源MRSA 自1972 年首次报道后，就引起了兽医界的重视。在比利时，从118 株乳房炎S.aureus 中分离出11 株MRSA，分型结果表明它们属于ST398 LA-MRSA[18]；在德国，从17 家奶牛养殖场临床型乳房炎奶样分离到25 株MRSA，牛场员工分离到2 株，均属于MLST ST398，spa 分型为spa type011(23 株)、spa type034(3 株)、spa type2576(1 株)，主要携带SCC mec typeⅤ。ST398 MRSA 为欧洲国家奶牛乳房炎MRSA 的一优势菌 系，同样ST8、ST1、ST239、ST329、ST8、ST425、ST130 和ST1245 在土耳其、匈牙利等欧洲国家的奶牛乳房炎奶样中零星发现[9]。亚洲地区关于奶牛乳房炎MRSA的研究报道较少，来自日本和韩国地区的研究报道表明，ST5、ST580、ST1 和ST72 MRSA 也从牛奶样中检出[9]。最近，Garcia-Alvarez 等第一次从奶牛乳房炎奶样中检出携带SCC mecⅪ染色体盒的MRSA[19]。表明ST398 与其它STs MRSA 都能引起奶牛乳房炎，而且存在地区性差异，虽然感染率并不高，但它的威胁仍很大。例如像ST398这样物种特异性不强且具有传播性的菌株，一旦在牛群中传播开来将会给奶牛养殖业带来严重的威胁。

3.2.3 MRSA 在马中的流行 MRSA 感染或定植于马主要与环境、创伤和与其接触者等有关。在人群中流行的USA500 ST8 MRSA 和ST254 MRSA 均在马中发现，推测是源于人类[20-21]；ST398 MRSA 也在马中发现，其定植率达10.9 %[22]。不同MRSA 可感染或定植于马，给马的健康带来潜在性威胁。

3.3 MRSA在家禽中的流行 MRSA 感染和定植家禽的报道并不多见。从肉鸡样品中分离出的8 株MRSA，分型表明均属于spa type t1456，MLST 分型的ST398[23]。从鸡肉、火鸡肉及其加工产品中也分离到37.2 %(32/86)的MRSA，其中28 株的MLST 分型为ST398，spa 分型为t011、t034、t899、t2346 及t6574，含SCC mec typeⅣ或Ⅴ；2 株的MLST 分型为ST9，携带SCC mec 染色体盒和spa type t1430；剩余2 株分别属于MLST 分型的ST5 和ST1791，都携带SCCmec typeⅢ染色体盒，都是spa 分型的t002[24]。

4 MRSA在人与动物之间相互传播的情况

多数关于MRSA 在不同物种间传播的研究，是对分离自不同动物和与其直接或间接接触人类的MRSA 做耐药谱型和分子分型。研究资料显示，源于动物和人的MRSA 无法用基因型和耐药普型加以区分，所以推测是MRSA 在人与动物之间相互传播，但MRSA 在不同物种间传播目前仍尚无定论。一种不能用PFGE 分型，MLST分型为ST398，携带spa-type108 和SCC mec type Ⅴ的LA-MRSA 从猪、猪场员工及一位猪场员工的妻子和幼女中分离到，表明其在人类和猪之间相互传播[25]。MRSA 在人和奶牛间的传播也有报道，27 株分离自亚临床型奶牛乳房炎和一株牛场员工的MRSA 无法通过耐药谱型和基因型加以区分，表明存在MRSA 在奶牛和人之间相互传播的可能[26]。类似情况也在宠物和人之间发生，从一只健康犬和携带MRSA 主人上分离的两株MRSA 具有完全一样的PFGE 和SCC mec 分型结果，表明MRSA 可能从人传播到犬[27]。种种事实表明，可能存在MRSA 在人和动物间相互传播的现象，虽然目前不能确定具体的传播方，但MRSA 在不同物种间的传播必将引起公众对社会公共卫生安全的高度担忧。

5 结语

细菌在抗生素的持续选择压力下，对其产生的抗性也越来越强。虽然目前很难断言MRSA 给公共卫生安全带来多大的危害，但作为人和动物感染的主要病原菌，它确实已给人类疾病的防治造成极大的困难；同时，对动物健康、兽医临床及食品安全具有很大的威胁挑战，因此，对不同感染源及地域的MRSA 进行深入的流行病学研究显得尤为重要。

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