牛源大肠杆菌的分离鉴定

郭 伶

（辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁 锦州 121001）

犊牛大肠杆菌病又称犊牛白痢，是由大肠杆菌引起的一种急性传染病，临床以排出灰白色的稀粪、全身败血、衰竭和脱水为主要症状。大肠杆菌广泛地分布于自然界，犊牛出生后即可随乳汁或其他食物进入胃肠道，成为肠道的正常菌。新生犊牛当其抵抗力降低或发生消化障碍时，均可引起发病。新生10日龄内的奶牛犊发生以腹泻为主要症状的疾病，具有较高的发病率、致死率，给奶牛养殖业带来了严重的经济损失［1］。犊牛大肠杆菌病的发病率和死亡率因有无继发和并发感染、饲养管理水平、环境卫生条件、采取措施是否及时有效而差异较大［2］。2014年2～4月份，辽西某奶牛养殖场发生了新生犊牛以严重腹泻、脱水等临床症状，发病的犊牛多为出生后1个月以内的小犊牛，有的来不及用药即发生死亡，有的治疗也无效。经对发病犊牛的直肠内采取粪便样品进行致病性大肠杆菌的分离鉴定，并对分离菌株进行药物敏感性试验，为临床合理选择药物，有效防治犊牛大肠杆菌病提供理论依据。

1 材料

1.1 病料采集

从辽西某发病奶牛养殖场无菌采集病料，将灭菌棉拭子在灭菌生理盐水中润湿，在发生腹泻犊牛的直肠内采取粪便样品，置于0～4℃的冰箱中保存备用。

1.2 实验动物

小白鼠20只，用于致病性试验，购自辽宁医学院实验动物中心。

1.3 主要仪器设备

显微镜、医用净化工作台、电热恒温培养箱、生物安全柜、手提式高压蒸汽灭菌器等。

1.4 培养基及试剂

培养基：普通肉汤、普通琼脂培养基、SS琼脂培养基、麦康凯琼脂培养、三糖铁琼脂斜面、伊红美蓝琼脂平板、MH培养基（药敏试验用培养基）等均按文献［3］的方法制备。

生化试剂：各种糖发酵管、MR试剂、VP试剂、硝酸盐还原试验用甲液和已液、柠檬酸盐试剂、吲哚试验试剂、硝酸盐、靛基质、尿素等，大肠杆菌标准血清（O1、O2、O26、O78）成都生物制品研究所（批号20130901）。药敏纸片购于上海医华医学科技有限公司，批号20131008。

2 方法

2.1 涂片、染色镜检

将采取粪便样品进行涂片，经革兰氏染色后，用显微镜检查。

2.2 细菌的分离培养

将采集到的粪便样品接种于普通肉汤培养基和普通营养琼脂培养基上，37℃培养24h后，涂片进行革兰氏染色后镜检。挑取普通营养琼脂培养基上表面光滑，边缘整齐，灰白色半透明的单个菌落，接种于麦康凯和伊红美兰琼脂平板培养基上，在37℃的条件下培养24h，观察结果。

2.3 生化试验

将纯培养菌株，移种于乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、半固体琼脂、尿素琼脂、三糖铁和葡萄糖培养基中，在37℃培养24h，观察在各种培养基中的生长情况，并进一步进行MR、VP和吲哚试验。

2.4 血清型鉴定

平板凝集抗原的制备：用0.5%石碳酸缓冲盐水2ml，将琼脂斜面的菌落洗下，集于瓶中，121℃高压处理2h，以破坏其k抗原。

平板凝集反应：取一张清洁的玻片，分别将一滴O1、O2、O8、O26和 O78的大肠杆菌标准血清滴至玻片上，再取等量制备好的平板凝集抗原，与玻片上的标准血清混匀，同时做生理盐水对照。

2.5 致病性试验

取健康的小白鼠20只，随机分成两组：第一组10只，为试验组，皮下接种营养肉汤菌液0.1mL，观察发病情况；第二组10只，作为对照组，注射生理盐水。观察小白鼠发病情况，对死后的小白鼠组织进行革兰氏染色、镜检、培养性状观察、细菌运动性检查、生化鉴定等。

2.6 药物敏感性试验

将分离的大肠杆菌纯培养物涂布于营养琼脂培养基上，在每个营养琼脂平板培养基上放置5个药敏片，置于37℃温箱培养中培养24h后取出，测量抑菌环直径。所用的药敏纸片有：头孢噻呋钠、青霉素、链霉素、庆大霉素、恩诺沙星、四环素、环丙沙星、氟苯尼考、磺胺－5－甲氧嘧啶、新霉素、多粘霉素B、氧氟沙星、卡那霉素、丁胺卡那霉素、林可霉素。

3 结果

3.1 涂片染色镜检结果

均可见两端钝圆，多数散在排列，偶尔有2～3个连在一起的革兰氏阴性短杆菌。

3.2 细菌的分离培养

普通肉汤浑浊、形成菌膜、底管有少量沉淀；在普通营养琼脂培养基上形成呈圆形、光滑、不透明、中等大小、粘稠、微隆起、边缘整齐的菌落；在麦康凯琼脂培养基上形成中等大小的粉红色菌落；在血液琼脂平板上在呈β溶血；在伊红美蓝培养基上呈现大肠杆菌特有的紫黑色带金属光泽菌落。

3.3 生化试验

分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖产气、产酸；不分解尿素，尿素酶为阴性；硫化氢反应阴性；MR试验阳性；VP试验阴性；三糖铁上的反应情况为表面黄色产酸，底部黄色产酸，产气，不产生硫化氢；吲哚试验阳性。

3.4 血清型试验

经血清型鉴定，在发病犊牛直肠内采取粪便样品中分离到的菌株为O78。

3.5 致病性试验结果

注射了肉汤纯培养物的小白鼠均发病死亡，对照组小白鼠未见任何症状。死亡小白鼠死前精神萎靡、腹部发钳、厌食、被毛蓬松。解剖死亡小白鼠后发现，肺部有出血点，肝脏、脾脏有不同程度的水肿，无菌采取肝脏、脾脏病料，涂片，革兰染色、镜检，并进行细菌分离培养，所得结果与粪便中分离菌相同。

3.6 药物敏感性试验结果

所分离菌株对头孢噻呋钠、卡那霉素、氧氟沙星的高度敏感；对磺胺－5－甲氧嘧啶、庆大霉素、恩诺沙星、氟苯尼考、新霉素、四环素、多粘霉素B中度敏感；对青霉素、环丙沙星、链霉素、林可霉素、丁胺卡那霉素耐药。

通过对发病犊牛的直肠内采取粪便样品进行细菌涂片、染色、镜检、分离培养、生化鉴定、致病性试验结果等可以确定，该牛场犊牛腹泻病主要是由致病性大肠杆菌引起的细菌性腹泻。结合药敏试验，临床可首选头孢噻呋钠、卡那霉素、氧氟沙星等药物进行治疗。

4 讨论

在病原菌的分离鉴定中，应注意无菌操作，以保证分离到病原菌的纯培养物。采集病料时，应采取含病原菌最多的部位，以保证能顺利分离到病原。待检材料应该放到灭菌容器中，整个取材过程要求无菌操作。能否获得纯培养，在很大程度上取决于分离技术。

致病性试验结果表明，分离到的大肠杆菌毒力较强，使小白鼠全部死亡。本次分离到的致病性大肠杆菌经血清型鉴定确定其血清型为O78，与东北地区流行血清型相一致。

近些年来，为了控制和预防某些细菌感染，在饲料添加剂及治疗中常盲目使用一些抗菌药物，导致产生许多耐药菌株。大肠杆菌易产生对抗生素的耐受性。由药敏试验结果可见，对青霉素、环丙沙星、链霉素、林可霉素、丁胺卡那霉素敏感性较低。这可能与该场长期或大量使用该类药物，使致病菌已产生耐药性有关。抗菌药物的广泛应用以及在疾病治疗和农牧业生产中超量不当使用抗生素，使细菌对一种甚至多种常用抗菌药物产生耐药，加之耐药基因的传代、转移、传播、扩散，耐药病原菌越来越多，耐药程度越来越严重，形成高度和多重耐药性，严重影响药物治疗效果和经济效益。因此建议临床治疗大肠杆菌病时，应先分离出大肠杆菌进行药敏试验后，再合理选择用药，可缩短治疗时间，减少养殖户的经济损失，同时也避免出现耐药菌株。

［1］ 王明辉，刘得元.犊牛大肠埃希菌病的发病原因及防治［J］.中国牛业科学，2006，32（6）：112－113.

［2］ 宋冰冰，李强.犊牛大肠杆菌病的症状分析及防治［J］.畜牧兽医科技信息，2010，（11）：42.

［3］ 陆承平.兽医微生物学［M］.3版.北京：中国农业出版社，2001.