FH/Wjd大鼠酒精性肝损伤模型探讨

张彦芬，秘尧，何奇龙，王宏涛

(河北以岭医药研究院，石家庄 050035)

FH/Wjd大鼠是纽约卫生中心 W．Jean Dodds 教授将远交系Wistar大鼠近亲繁殖了 19 代得到的，这个品系的大鼠具有遗传性5-HT功能低下和大量自主饮酒的特点[1]。北京大学中国药物依赖性研究所于2007年将FH/Wjd大鼠引入我国并成功繁殖，是我国第一个先天嗜酒的大鼠模型，同时也是一个先天抑郁症的模型。目前主要用于精神依赖物质及其戒断的研究。我们根据其嗜酒特性，观察了长期饮酒后FH/Wjd肝脏病变相关指标，探讨其作为肝脏损伤动物模型的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物

SPF级FH/W jd大鼠36只，雌雄各半，12～16周龄。雄性体重280～320 g，雌性体重160～200 g。来源于北京大学医学部实验动物科学部[SCXK(京)2011-0012]。动物饲养于河北省中西医结合医药研究院新药评价中心[SYXK(冀)2009-0033]，光照12h/d，温度20～25℃，相对湿度40%～70%。

1.1.2 主要试剂

无水乙醇购自天津市大茂化学试剂厂。丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(CHO)生化检测试剂盒购自北京九强。组织TG试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司。组织谷胱甘肽(GSH)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。PPARα一抗购自Abcam美国公司。

1.2 方法

1.2.1 造模方法[2]

将36只大鼠单笼饲养，按体重随即分为2组，即饮水组和饮酒组。饮水组每日自由摄取无菌水，饮酒组自由饮用15%乙醇溶液，持续16周。每周2次监测饮酒组大鼠乙醇摄入量，计算公式如下(ME为纯乙醇摄入量，mE为乙醇溶液摄入量，CE为乙醇浓度，ρE为乙醇密度，ρW为水密度，BW为体重)：

1.2.2 指标检测

10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，4℃、3000 r/min转离心10 min，分离血清，全自动生化分析仪检测血清ALT、AST、TBIL、TG、CHO。取肝脏组织约100 mg，70%乙醇固定，制成单细胞悬液，碘化丙啶染色，Epics XL流式细胞仪检测，用cxp Analysis软件分析细胞凋亡率。取肝脏组织200 mg，制备组织匀浆，检测肝脏匀浆中TG、GSH。取肝脏组织约100 mg，Western法检测肝脏组织过氧化物酶体增殖物激活受体α[3,4](peroxisome proliferator-activated receptor alpha, PPARα)蛋白表达。留取部分肝脏甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，观察肝脏病理组织学改变。

1.2.3 统计方法

2 结果

2.1 血清生化

雄性大鼠饮酒组与饮水组相比，TBIL与TG明显升高，且有统计学差异(P<0.05或P<0.01)；转氨酶及CHO略有降低，但无统计学差异。雌性大鼠饮酒组与饮水组相比，除TBIL与TG明显升高外(P<0.05或P<0.01)，ALT、CHO降低更为明显，且有统计学差异(P<0.05)。见表1、表2。

表1 酒精摄入对雄性FH/Wjd大鼠血清生化指标的影响±s，n=9)

表2 酒精摄入对雌性FH/Wjd大鼠血清生化指标的影响±s，n=9)

2.2 肝组织生化

雌、雄大鼠饮酒组与饮水组相比，肝组织匀浆液中TG含量均明显升高，且有统计学差异(P<0.01)；GSH含量有降低趋势，但未见统计学差异。见表3、表4。

表3 酒精摄入对雄性FH/Wjd大鼠肝组织生化指标的影响±s，n=9)

表4 酒精摄入对雌性FH/Wjd大鼠肝组织生化指标的影响±s，n=9)

2.3 肝细胞凋亡

雌、雄大鼠饮酒组与饮水组相比，肝细胞凋亡率有升高趋势，但未见统计学差异。见表5。

表5 酒精摄入对FH/Wjd大鼠肝脏细胞凋亡的影响±s，n=9)

2.4 肝PPARα蛋白表达

饮酒组与饮水组相比，肝脏组织PPARα蛋白表达明显降低，且有统计学差异(P<0.05)。见图1、图2。

图1 肝脏组织PPARα的蛋白表达

注：与饮水组相比，*P<0.05

2.5 组织病理学

饮水组肝组织结构正常，肝小叶结构完整，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞索、肝血窦排列规则，未见炎细胞浸润、肝细胞变性、坏死等病理变化。饮酒组可见肝细胞空泡变性(符合小泡性脂肪变的病理特点)、小灶性，多发，偶见坏死。见图3(彩插4)。

3 讨论

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是由于长期大量饮酒导致的肝中毒性损害，包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和肝硬化[5]。为了研究ALD的发病机制，筛选有效的治疗药物，建立相应的动物模型是非常有必要的。

关于酒精性肝损伤的动物模型主要有强制灌酒、自由摄入酒精食料(Lieber-Decarli)[6-8]，前者乙醇溶液浓度过大或体积过大都会严重损伤消化道，长期灌胃酒精大鼠死亡率高，短期则造成乙醇摄入量低；后者由于大鼠厌酒，也会导致乙醇摄入量受限。为控制厌酒的大鼠的酒精摄入，以保证血液中长期维持高浓度的酒精，1984年Tsukamato-French等[9]给SD大鼠手术植入胃管，持续注入含酒精的液体食料。但该模型中酒精是强制注入的，不符合正常摄入过程，并且制作此模型需要一些技术上的特别训练，不易复制。FH/W jd大鼠先天嗜酒特性使其在自然状态下可以自由饮用大量酒精，与人类饮酒行为非常相似，实验操作简便易行。

从本次实验数据可以看出，FH/Wjd大鼠自由饮酒16周后，血清TG和TBIL变化较大，从GSH可以推测肝脏可能出现了氧化损伤，而病理改变则以小泡性脂肪变性为主，这与肝脏TG含量升高吻合。与脂代谢密切相关的PPARα的蛋白表达受到了明显影响，并且肝细胞凋亡率有升高趋势。饮酒组大鼠血清CHO有所降低，雌性动物降低程度尤为明显，可能是由于肝细胞受损，胆固醇酯生成减少，导致血清胆固醇总量降低。饮酒组大鼠血清AST、ALT均呈现降低趋势，同时血清TBIL水平升高，其中雌性大鼠ALT降低较为明显，与饮水组出现了显著统计学差异。临床上这种胆酶分离的现象是由于肝细胞大量坏死，对胆红素的处理能力进行性下降，同时转氨酶进行性耗竭造成的，所以我们推测FH/Wjd大鼠这种血清生化指标的改变与肝细胞受损或坏死有关。

本模型采用了两种性别的动物，从数据来看，雌雄动物各数据的变化趋势是一致的，但变化程度有一定差异，雌性动物变动幅度较雄性动物略大。在乙醇摄入量监测时发现，雌性动物乙醇摄入量高于雄性动物，故推测病变程度性别差异可能与此有关。本研究对FH/Wjd大鼠作为酒精性肝损伤动物模型的可行性进行了初步探讨，此模型仍然有待我们进一步深入研究。

(本文图3见彩插4。)

[1] 李雨玲, 梁建辉.FH/Wjd大鼠的生物学特性及其在药理学研究中的应用 [J]．中国药理学通报, 2012, 28(7):893-897．

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[5] 陈灏珠, 林果为, 廖履坦, 等.实用内科学 [M]．第13版．北京: 人民卫生出版社, 2009:2098．

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