黄芪多糖对Lewis 肺癌小鼠细胞因子及顺铂所致免疫功能低下的影响

明海霞，陈彦文，胡永浩，董晓丽，顾静，李杨

(1.甘肃农业大学动物医学院， 兰州 730070；

2.甘肃中医学院生理教研室，甘肃省中药药理与毒理学重点实验室， 兰州 730000；

3.甘肃中医学院解剖教研室，甘肃省中药药理与毒理学重点实验室， 兰州 730000)

根据IARC(国际癌症研究机构)发布的最新在线数据库“全球癌症2012”(GLOBOCAN 2012)统计数据显示，2012年，全球癌症新发病例上升到1410万人，另外有820万人死于癌症，其中发病率和死亡率均居首位的是肺癌[1]。目前化疗仍是肺癌综合治疗的主要手段，但副作用大，因此寻找一种对肿瘤细胞有高效的杀伤或抑制作用，而对正常细胞无毒性或有保护作用的化疗药物显得尤为重要。现代研究表明，黄芪多糖(Astragaluspolysaccharide，APS)可增强肿瘤抑制，减少毒副反应，并可增进机体细胞免疫功能，改善肿瘤患者的生活质量[2]。为进一步探讨APS辅助抗肿瘤机制，揭示其与荷瘤小鼠免疫功能之间的关系，本辅助化疗可增强肿瘤抑制，减少毒副反应，并可增进机体细胞免疫功能，实验观察不同浓度APS对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长、细胞因子及DDP所致免疫功能的影响，为揭示APS的抑瘤和增效减毒机理提供依据。

1 材料与仪器

1.1 细胞株及动物

小鼠Lewis肺癌细胞株(LLC)中国科学院上海生命科学研究院细胞库提供。

SPF级C57BL/6小鼠，雄性，共90只，6～8周龄，体重约(20±2)g，由兰州大学医学院实验动物中心提供【SCXK(甘)2013-0002】；实验设施使用证【SYXK(甘)2011-0001-0001110】。

1.2 主要药品

黄芪多糖(APS)：陕西昂盛生物医药科技有限公司，产品批号：Uhqdt130518；使用时将黄芪多糖干粉剂用生理盐水溶解，灭菌，4℃冰箱保存备用。顺铂注射液(DDP)2 mL：每支10 mg，云南个旧生物药业有限公司，批号：120201。

1.3 主要试剂

HyClone High Glucose DMEM、胎牛血清、磷酸盐缓冲液(PBS)：均购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司(批号：NYE0885、NVJ0313、NYE0884)；小鼠IL-2、IL-6、IL-12、TNF-αELISA 试剂盒均购自武汉博士德生物工程公司(批号：2012920)。

1.4 主要仪器

新苗牌超净工作台：上海新苗医疗器械制造有限公司；Heal Force HF151-CO2细胞培养箱：香港力康发展有限公司；美国Bio-Rad iMark酶标仪，购自上海众生生命科学发展有限公司；CT14RD型高速冷冻离心机，购自天美科技有限公司；AR224CN电子天平，购自奥豪斯仪器(上海)有限公司ZHWY-110X30；AE31EF-INY荧光倒置相差显微镜：Motican Pro。

以上仪器由甘肃中医学院基础医学实验教学中心和中药药理与毒理学重点实验室提供。

2 方法

2.1 细胞培养

将小鼠Lewis肺癌细胞培养于含10%新鲜胎牛血清的DMEM培养基(含青、链霉素各100 IU /mL)中，37℃、体积分数为5% CO2、饱和湿度的培养箱中连续培养。至对数生长期(80%铺满全层)时，用质量分数为0.25%胰酶常规消化，将细胞调整为1×107个/mL的悬液。

2.2 肺癌移植瘤模型的建立、分组及用药

90只小鼠，设空白对照组10只，余80只依次造模[3]：将复苏的Lewis肺癌瘤株，接种于3只小鼠右腋窝皮下以保种，每10d转种一次，连续2次，正式实验时，选取生长良好的Lewis肺癌组织，剪碎匀浆，按照肿瘤质量(g)与生理盐水(mL)1∶3匀浆制成细胞悬液，经0.2%台盼蓝染色后计数活细胞数>95%，调整细胞浓度为每毫升1×107个。接种于C57BL/6J小鼠右前肢腋窝皮下，每只约0.2 mL，全程严格无菌操作。将造模的小鼠随机分为8组，每组10只：模型组(等体积生理盐水)，顺铂阳性对照组(6 mg/kg DDP)，APS低(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、高剂量(200 mg/kg)组，联合用药低、中、高剂量组(DDP剂量减半，APS各剂量同上)，于造模次日起各组分别腹腔注射等体积的药物0.3 mL。DDP每周一次，其余药物每天1次，连续20 d。

2.3 标本检测

于第21天安乐处死，眼球摘取采血，放置4 h后离心，分离血清，放于-20℃备用。临用前平衡至室温，按照ELISA试剂盒说明书步骤进行操作，测定细胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α的水平。

取标本：常规分离组织，称体重、脾重、胸腺、肿瘤组织的重量，并将肿瘤组织一半用4%多聚甲醛固定，一半用冷生理盐水冲洗后备用。计算脾指数、胸腺指数及抑瘤率。脾指数(mg/g)=脾重(mg)/体重(g)，胸腺指数(mg/g)=胸腺重(mg)/体重(g)，抑瘤率=(1 - 实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)× 100%。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 移植瘤模型建立结果

接种后5 d左右即可于右腋下扪及小肿块即实体瘤。与阴性对照组相比，早期体重增大，后DDP化疗组小鼠体重呈下降趋势，小鼠皮毛糙杂，活动受限，实验结束时解剖均可得肿瘤。

3.2 黄芪多糖对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长的影响

与模型对照组比较，黄芪多糖低、中、高剂量组和顺铂组荷瘤小鼠瘤质量显著减轻，黄芪多糖低、中、高剂量组与顺铂组比较，小鼠瘤质量差异无显著性(P>0.05)。而联用黄芪多糖可以显著提高对小鼠Lewis肺癌细胞的抑瘤率，与顺铂组比较差异有显著性(P<0.05)。见表1。

表1 APS对Lewis肺癌移植瘤生长的影响及对DDP增效作用± SD，n=10)

3.3 黄芪多糖对Lewis 肺癌小鼠细胞因子的影响

黄芪多糖可提高Lewis 肺癌小鼠血清中细胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α的水平，与模型组比较差异有显著性(P<0.01或P<0.05)；DDP阳性对照组血清中细胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α的水平则降低，与模型组比较差异有显著性(P<0.01或P<0.05)；联合用药组血清中各细胞因子与DDP组比较差异有显著性(P<0.01或P<0.05)。见表2。

表2 APS对Lewis 肺癌小鼠细胞因子的影响±s，n=10)

3.4 黄芪多糖对Lewis肺癌移植瘤小鼠DDP所致免疫器官指数的影响

与空白对照组比较，黄芪多糖中、高剂量组和联合用药组脾脏指数显著升高；与模型组比较，黄芪多糖高剂量和联合高剂量脾脏指数差异有显著性(P<0.05)；与DDP组比较，黄芪多糖各剂量和联合应用黄芪多糖组小鼠胸腺指数和脾脏指数均升高。见表3。

表3 APS对Lewis肺癌移植瘤小鼠免疫器官指数的影响及对DDP减毒作用±s，n=10)

4 讨论

中医认为，恶性肿瘤的发生与机体正气亏虚密切相关，正气亏虚，邪气乘虚而入则易患肿瘤。现代医学认为，当免疫系统失去监视功能时，就会导致肿瘤的发生，而肿瘤分泌的一些细胞因子会抑制机体的免疫功能，使肿瘤进一步发展、转移，因此免疫功能紊乱是肿瘤发生发展的关键。外界的致癌因素只是促使肿瘤发生的外部条件，这个观点与中医学的“正虚致瘤”的理论是一致的。据报道化疗药物在抗肿瘤的同时，免疫器官指数明显下降，严重损害免疫器官[4]，说明其抗瘤疗效好的代价是在损伤整体的基础上实现的。

近年研究证实，许多中药可以通过提高肿瘤宿主的免疫功能等干扰肿瘤的生长、代谢、增殖过程，最终使肿瘤细胞发生死亡或凋亡[5]，同时发挥整体调节作用，从而延长肿瘤患者的生存期。黄芪是传统扶正固本中药，其成分中黄芪多糖类和黄芪皂苷类物质具有增强机体免疫功能的作用，运用黄芪调节人体免疫功能的作用来治疗疾病，体现了中医扶正治疗的原则[6]。

IL-2能诱导产生细胞毒T淋巴细胞、刺激T细胞增殖分化、诱导干扰素等多种细胞因子的分泌、增强NK细胞活性，具有增强机体免疫功能等多方面作用，是一种免疫增强剂。IL-2含量高低反映了宿主免疫系统清除自身损伤细胞、衰老变性细胞、自体变性方面的能力大小及宿主T淋巴细胞活化程度。IL- 6可以介导免疫球蛋白的分泌、加强终末B细胞的分化、促进细胞毒T细胞和NK细胞溶解细胞的能力、提高T细胞活化信号。各种细胞因子可以直接调节癌细胞的生长，抑制癌细胞增殖或促使癌细胞分化，也可以通过诱导细胞因子网络的其他成员发挥作用，因为在参与机体免疫反应的过程中，它们并非独立作用，而是存在于相互依存的复杂网络之中。

本实验首次研究APS及APS联合化疗药物DDP对Lewis肺癌小鼠血清中IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α及免疫功能的影响，探讨其抗肿瘤的机制和对DDP的增效减毒作用。结果显示，APS能提高Lewis 肺癌小鼠血清中细胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α的水平；增强DDP所致免疫功能低下小鼠的免疫功能，对免疫器官有一定的保护作用；能抑制小鼠Lewis肺癌细胞的生长，在与DDP减半量联合使用时可使DDP抑瘤作用增强，且其机制可能与增强机体的免疫功能有关，说明APS在抑制肿瘤生长的同时可能通过提高荷瘤小鼠血清中细胞因子水平而提高免疫功能，增强自身抗肿瘤能力，并对DDP有一定的增效减毒作用，与单纯的化疗药物比较，有独特的优势。有关黄芪多糖的抗肿瘤机制及对免疫系统的其它影响，值得进一步深入研究和应用。

[1] Parkin DM, Bray FI, Devesea SS.Cancer burden in the year 2000：The global picture [J].Eur J Cancer, 2001, 37(Suppl):64-66.

[2] 刘跃华, 黄静, 王雍.注射用黄芩多糖联合化疗治疗中晚期胃癌的疗效[J].实用医学杂志, 2011, 27(3):516-518.

[3] 梁靓靓.调气消积汤对 Lewis 肺癌小鼠抑瘤作用的实验研究 [D].辽宁中医药大学，博士论文.2010：10

[4] 孙震晓, 孙晋华, 程霜, 等.中药地椒提取物的抗肿瘤作用及对小鼠免疫功能的影响 [J].中西医结合学报, 2003，9(1): 238.

[5] Ebina T, Ogarm N, Sl1imanuki H, et al．Life-prolonging effect of immune cell BAK(BRM-activated killer)therapy for advanced solid cancer patients：prognostic significance of serum acidic protein levels [J]．Cancer Immunol Immunother, 2003, 52(9):555-560.

[6] 吴宝明, 李俊.黄芪多糖在免疫调节中的作用 [J].安徽医药, 2008, 12(7):577-579.