血浆检测microRNA－125a－3p、IGF－2在监测NSCLC侵袭转移中的价值＊

张洪川，徐艳梅，周 璞，孙建国，陈正堂

（第三军医大学附属新桥医院全军肿瘤研究所，重庆 400037）

在世界范围内，肺癌为恶性肿瘤死亡的首要原因，非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌的80%［1］。肺癌的病死率高主要原因是诊断时大部分肺癌已经是晚期［2］，临床诊断的时候，高达75%的肺癌已经局部晚期和（或）远处转移［3］。远处转移是晚期NSCLC治疗失败最常见的原因之一，大部分患者是死于转移灶引起的相关并发症。因此，找到一种简便、可靠的方法去监测转移是非常重要的。microRNA（miRNA）的发现打开了分子标志物的一个新领域。2008年首次发现外周血中富含大量的稳定miRNA，这使在血浆中寻找肿瘤生物信号成为可能。miRNA可以以一个被保护的状态存在于血浆中，因此可以直接从血浆中检测到。Roth等［4］研究报道，肺癌患者血浆microRNA－141（miR－141）和 miR－155明显高于良性患者，高水平miR－10b预示着淋巴结的转移。这些数据显示，某些血浆miRNA能够预测肺癌的发展和预后。已有报道血尿中miR－125a－3p在健康人与系统性红斑狼疮（SLE）、乳腺癌等之间存在差异表达，然而在肺癌患者外周血中的表达情况还不清楚。用3种常用的生物信息学软件TargetScan、PicTar和miRanda预测miR－125a－3p的靶基因，发现胰岛素样生长因子2（insulin－like growthfactors 2，IGF2）在3种软件中都能够被预测到，而且，miR－125a－3p在IGF2的3′非编码区（3′UTRs）有2个结合位点，因此，IGF2 可能为miR－125a－3p的靶基因［5］。IGF2是一种重要的促胚胎细胞生长因子，也是一种促有丝分裂肽，具有促进细胞有丝分裂、胚胎形成、产后生长发育等作用，生理条件下对胚胎的正常生长发育有重要作用，病理条件下能刺激肿瘤细胞的增殖。目前，IGF2被认为是多种肿瘤重要的自分泌生长因子，其过度表达已被证实具有促进细胞增殖及恶性转化的作用［6］。本研究主要检测血浆中 miR－125a－3p、IGF－2的表达水平，探讨其在NSCLC侵袭转移中的价值，研究二者表达之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集93例血浆标本其中20例健康成人（健康对照组），男12例，女8例；年龄27～75岁，中位年龄59岁。73例NSCLC患者，均为初诊患者，经病理科诊断为NSCLC后入组，根据影像学资料进行TNM分期。Ⅰ／Ⅱ期组33例，男18例，女15例；年龄36～78岁，中位年龄62岁；鳞癌15例，腺癌18例；其中，Ⅰ期19例，Ⅱ期14例。Ⅲ／Ⅳ期组40例，男21例，女19例；年龄37～82岁，中位年龄60岁；鳞癌14例，腺癌26例；其中，Ⅲ期13例，Ⅳ期27例。分期根据肿瘤分期系统（2009）。所有的血液标本采用5mL乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管收集，均在患者做手术和治疗前收集。在2h内将收集的血液标本在4℃离心机中3000r／min离心15min。收集上清液立即储存于－80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 在http：∥www.mirbase.org网站查找人－miR－125a－3p、线虫－miR－39序列并设计引物，引物合成由广州锐博生物科技有限公司完成。

1.2.2 总RNA的提取 应用Ambion mirVana PARIS试剂盒（Foster City，CA）提取600μL血浆样品中的总RNA，首先加入600μL的10%十二烷基硫酸钠（SDS）混匀在4℃条件下孵育1h对血浆样品进行预处理，为了控制样本间提取效率的差异，在样品加入变性液后加入25fmol人工合成的cel－miR－39进行校正。随后的总RNA提取步骤按试剂盒说明书进行。最后用30μL无酶水洗脱离心柱得到总RNA。应用分光光度计对RNA的纯度和浓度进行检测。

1.2.3 cDNA合成 取10μL总RNA使用PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real time试剂盒（RR037A）进行cDNA的合成。20μL反应体系如下：10.0μL总RNA，5×PrimeScript Buffer（for real time）4.0μL，人－miR－125a－3PRT－prime 0.5 μL，线虫－miR－39RT－prime 0.5μL，无 RNA酶水4.0μL，PrimeScript Enzyme MixⅠ1μL。反应条件为：42℃15min，85℃5s，之后保存于4℃。

1.2.4 实时定量－PCR（qRT－PCR）反应 采用 Applied Biosystems（ABI7500高通量实时荧光定量PCR系统），按照用户手册进行操作。采用20μL的反应体系，具体操作参照SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ的使用说明。最终确定的反应体系为20μL，包括cDNA 合成步骤的产物2.0μL，SYBR®Premix Ex Taq TMⅡ10.0μL，ROX Reference DyeⅡ0.4μL，正向、反向引物各0.8μL（10μmol／L），无RNA酶水6μL。反应过程具体为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火及延伸34s，扩增40个循环；结束后通过95℃15s，60℃1min，85℃15s，60℃15s制作溶解曲线。每管设3个复孔，冰上避光操作。反应结束后，系统自动得出熔解曲线。各个组之间的 miR－125a－3p表达量用2－△△Ct表示。

1.2.5 酶联免疫吸附实验（ELISA） 优尔生公司SEA051Hu 96T测定血浆IGF－2水平，严格按操作说明书进行。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行数据分析。标准化对于miRNA的准确定量是必不可少的，评估所有的miR－125a－3p的表达通过线虫 miR－39来标准化，应用2－△△Ct方法。根据Q－Q图、偏峰度计算推断数据不符合正态分布，数据均采用非参数检验，数据以中位数（25%百分位数至75%百分位数）表示。miR－125a－3p、IGF－2在2个独立样本组间表达差异使用 Mann－Whitney U 检验，在3个独立样本组间使用Kruskall－Wallis检验，应用Spearman相关分析法分析 miR－125a－3p与IGF－2的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

从20例健康对照组、33例Ⅰ／Ⅱ期、40例Ⅲ／Ⅳ期NSCLC患者血浆中检测了 miR－125a－3p、IGF－2的表达水平，本实验中得到的溶解曲线（图1）表明qRT－PCR产物均具有特异性。

图1 部分样本的溶解曲线

表1 血浆miR－125a－3p水平与NSCLC临床病理特征的关系

表2 血浆IGF－2水平与NSCLC临床病理特征的关系

续表2 血浆IGF－2水平与NSCLC临床病理特征的关系

2.1 血浆 miR－125a－3p、IGF－2的表达与 NSCLC临床病理特征的关系 NSCLC血浆miR－125a－3p的表达与临床分期、淋巴结转移状况差异有统计学意义（P＜0.05），与年龄、性别、分化程度、病理类型差异均无统计学意义（P＞0.05）。NSCLC血浆IGF－2与淋巴结转移状况有关（P＜0.05），与年龄、性别、分化程度、病理类型、临床分期无关（P＞0.05），见表1、2。

2.2 比较健康对照组、Ⅰ／Ⅱ期患者、Ⅲ／Ⅳ期患者血浆中miR－125a－3p水平 Kruskall－Wallis检验发现3组存在差异（χ2＝13.449，P＝0.001），见图2。进一步比较两两之间的差异，发现健康对照组1.276（0.742～2.396）ng／mL较Ⅰ／Ⅱ期组1.231（0.756～1.957）ng／mL表达差异无统计学意义（P＝0.776）。Ⅲ／Ⅳ期组0.666（0.407～1.098）ng／mL较健康对照组1.276（0.742～2.396）ng／mL低，差异有统计学意义（P＝0.005）。Ⅲ／Ⅳ期组0.666（0.407～1.098）ng／mL较Ⅰ／Ⅱ期患者组1.231（0.756～1.957）ng／mL低，差异有统计学意义（P＝0.001）。

图2 miR－125a－3p的表对表达水平

2.3 比较血浆中IGF－2水平在健康对照组、Ⅰ／Ⅱ期组、Ⅳ期组之间的差异 Kruskall－Wallis检验发现3组间存在差异（χ2＝7.147，P＝0.028）。进一步比较两两之间的差异，Ⅰ／Ⅱ期组IGF－2水平969.680（837.558～1066.264）ng／mL、Ⅲ／Ⅳ期组1014.501（813.720～1172.469）ng／mL较健康对照组779.191（696.856～906.369）ng／mL高（P＝0.036、P＝0.011）。Ⅰ／Ⅱ期组与Ⅲ／Ⅳ期组差异无统计学意义（P＝0.451）。

2.4 血浆 miR－125a－3p与IGF－2相关性分析 血浆中 miR－125a－3p表达与IGF－2表达呈负相关（r＝－0.280，P＝0.007）。

3 讨 论

miRNA在转录后水平调节基因表达。原发肿瘤通过播散侵袭进入周围组织，以及转移灶的生长都需要一系列协调事件，包括原发肿瘤灶肿瘤细胞的分裂，进入循环系统和远处病灶细胞的增殖。侵袭转移需要的一系列步骤涉及许多基因表达的改变［7］。关于miRNA已有研究证实有几个miRNA具有促进或抑制肿瘤转移的潜能。如miRNA－183可以抑制肺癌细胞的迁移和侵袭能力，可能为一种肿瘤转移抑制因子［8］。miR－221、miR－222通过活化AKT通路促进细胞的迁移［9］。目前，对 miR－125a的研究主要集中在 miR－125a－5p，大量的研究表明miR－125a－5p在肺癌中低表达，并且可抑制细胞侵袭转移的作用，现有报道表明mir－125a的另一成熟体miR－125a－3p在肿瘤中的作用也不容忽视［10］。已有研究证实 miR－125a－5p、miR－125a－3p都与 NSCLC侵袭转移密切相关。miR－125a－3p的表达与临床分期及淋巴转移呈负相关，miR－125a－3p在分期越晚、有淋巴结转移的肺癌组织越低。在肺癌细胞株中的体外研究揭示 miR－125a－3p可抑制细胞侵袭转移［8］。miR－125a－3p在胃癌组织比正常组织表达低，与转移、预后密切相关。有淋巴转移及远处转移的胃癌组织较没有转移的胃癌组织miR－125a－3p表达更低，差异有统计学意义（P＜0.05）。体外研究证实miR－125a－3p具有抑制胃癌侵袭转移的作用［10］。最近的报道显示，miR－125－3p通过靶向Fyn减少细胞扩增和迁移。miR－125a－3p过表达降低了FAK、paxillin和Akt的活性，阻断了细胞周期，破坏了细胞的生存和迁移能力［11］。miR－125a－3p在高转移人肺大细胞癌细胞株L9981中的表达水平明显低于在低转移人肺大细胞癌细胞株NL9980，提示miR－125a－3p可能具有抑制肿瘤转移的作用［12］。总之，越来越多的证据表明miR－125a－3p具有抑制肿瘤侵袭转移的能力。

本文对miR－125a－3p及其潜在的靶基因产物IGF－2的表达进行探索。miR－125a－3p在NSCLC外周血中的表达健康对照组与Ⅰ／Ⅱ期组差异无统计学意义（P＞0.05），表明miR－125a－3p不能作为NSCLC的早期筛查指标；但在TMN分期、淋巴结转移情况中发现了统计学差异，这可能与miR－125a－3p的功能相关，miR－125a－3p主要抑制细胞的迁移能力，抑制肿瘤的侵袭转移，过表达miR－125a－3p可以抑制细胞的侵袭迁移能力，低表达的miR－125a－3p可能作为肺癌侵袭转移的一个潜在标志物。有研究已证实IGF－2高表达与前列腺癌、直肠癌等多种肿瘤的发生发展密切相关，IGF－2在NSCLC组织中高表达，而且与淋巴结转移相关［13］。血清IGF－2在NSCLC及小细胞肺癌中较健康对照组高表达［14］。本研究发现IGF－2在NSCLC患者血浆中高表达，而且与淋巴结转移状况相关。miR－125a－3p可能负调控IGF－2的表达，具体机制还不明确，本研究发现了这一相关性，需后期的细胞实验去进一步验证。

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