乙型肝炎病毒及黄曲霉毒素暴露的肝细胞癌中β－catenin、PTEN 的 mRNA表达＊

陈德凤，齐鲁楠，彭 涛，罗国容，黎乐群△

（1.广西医科大学研究生学院，广西南宁 530021；2.广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科，广西南宁 530021；3.广西医科大学第一附属医院肝胆外科，广西南宁 530021；4.广西医科大学基础医学院，广西南宁 530021）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全世界最常见的恶性肿瘤之一［1］，其发病率在中国呈逐年上升趋势，2007年卫生部统计肝癌死因位于恶性肿瘤死因的第二位，并且乙型肝炎病毒（HBV）的高感染率和黄曲霉毒素B1（AFB1）的高暴露是原发性肝癌高发的主要因素 之一［2－3］。有研究表 明［4］，βcatenin基因突变与肝癌发生有关，而HBV与AFB1的高暴露均能够导致β－catenin基因的突变并同时影响β－catenin蛋白的磷酸化。9.5%肝癌患者抑癌基因第10号染色体缺失与PTEN基因存在第4、5和8外显子的突变［5］。肝癌的发生是一个多基因和多步骤的过程，肝癌发生、发展过程中HBV与AFB1可能共同作用促使β－catenin基因和PTEN基因发生改变，为探索HBV和AFB1不同暴露情况下β－catenin基因和PTEN基因mRNA表达与HCC的关系，本研究运用逆转录－PCR（RT－PCR）法从基因水平检测β－catenin和PTEN 基因表达情况，为HBV及AFB1高暴露的地区开展HCC的预防和早期诊疗研究提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 108例HCC组织标本收集于广西医科大学附属第一附属医院肝胆外科和广西医科大学附属肿瘤医院的标本库，标本时间为2008年5月至2010年7月，同时设正常对照组20例，取自正常肝组织标本，主要为肝血管瘤、肝外伤、肝移植供体标本。手术标本的病例包括男95例，女13例；年龄28～78岁，平均48.6岁；肝癌直径为2.0～16.5cm，平均6.8cm。HBV暴露阳性标准为血清中HBsAg（＋），AFB1暴露标准为癌组织中AFB1－DNA加合物免疫组织化学阳性［6］。根据上述检测结果以及研究目的，108例HCC患者根据HBV与 AFB1的暴露情况，分为4组，A组：HBV（＋）／AFB1（＋）48例；B组：HBV（＋）／AFB1（－）27例；C 组：HBV（－）／AFB1（＋）19例；D组：HBV（－）／AFB1（－）14例。所有患者术前均未接受放化疗处理，术后病理诊断均证实为HCC，所有选取的病例均履行告知义务并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 AFB1－DNA加合物检测方法 免疫组织化学染色：参照Santella等［7］的染色步骤。需同时设立阳性和阴性对照（对照组的大鼠肝组织均由美国哥伦比亚大学Regina M.Santella教授惠赠）。阳性对照取1年雄性SD大鼠行腹腔注射AFB11.0mg／kg和2.5mg／kg剂量，2h后处死取大鼠肝组织，未行腹腔注射AFB1的大鼠肝组织作为阴性对照。经免疫组织化学染色后在显微镜下观察，阳性定义标准为切片背景清晰同时肝细胞核结构完整，在细胞核内出现紫黑色点状颗粒。阴性定义标准为在肝细胞核内无紫黑色点状颗粒。

1.2.2 RT－PCR法检测β－catenin与PTEN 基因的表达

1.2.2.1 癌组织总RNA的提取、RNA逆转录成cDNA 以Trizol试剂提取总RNA，紫外分光光度计测OD值，计算RNA含量和纯度。用Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis试剂盒进行RNA逆转录。

1.2.2.2 PCR引物的设计与合成 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。根据Genebank中公布的人β－catenin基因、PTEN 和GAPDH 基因的 mRNA序列，使用Primer Premier5.0引物设计软件进行设计，并使用BLAST验证为基因的特异性引物（各基因的正义引物和反义引物序列均跨至少一个内含子）。

1.2.2.3 PCR反应条件 将各试剂按顺序加入到PCR反应管中并混合后分装，每管的总反应体系为25μL。所用试剂为北京天根公司2×Tap PCR MasterMix，包括：2×MasterMix 12.5μL，上下游引物各1.0μL，DNA模板10～100ng，灭菌双蒸水补至25μL。反应条件：β－catenin 基因：95℃预变性5 min；变性95℃30s，退火54℃40s，延伸72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。PTEN基因：95℃预变性5min；变性95℃30s，退火57℃40s，延伸72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。GAPDH基因反应条件：95℃预变性5min；变性95℃30s，退火55℃40s，延伸72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。以上反应均终止于4℃。

1.2.2.4 PCR产物分析 将PCR产物电泳后的凝胶置于分析仪观察，同时拍下图片进行分析。图片结果采用Quantity One软件分析基因的灰度值，平均灰度值减去背景灰度值之差为统计分析数值，β－catenin基因与PTEN 基因的统计值为其灰度值与GAPDH 灰度值之比。

1.3 统计学处理 采用SPSS18.0软件进行统计学处理。计量资料的各组间均数比较，符合正态分布采用方差分析或成组设计两样本t检验，不符合正态分布的资料采用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 β－catenin基因mRNA的表达情况 RT－PCR结果显示，β－catenin基因mRNA的平均半定量灰度值A组、C组分别与D组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。此外，4个亚组与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1、图1。

表1 各组β－catenin mRNA半定量灰度值比较（）

表1 各组β－catenin mRNA半定量灰度值比较（）

a：P＜0.05，与 A组比较；b：P＜0.05，与B组比较；c：P＜0.05，与C组比较；d：P＜0.05，与D组比较。

48 1.13±0.14 B组 27 1.06±0.12 C组 19 1.16±0.18 D组 14 1.01±0.13ac正常对照组 20 0.85±0.13灰度值A组组别 n abcd

图1 各组β－catenin mRNA半定量灰度值

2.2 PTEN基因mRNA的表达情况 RT－PCR的结果显示，PTEN基因mRNA的平均半定量灰度值A组与C组及B组与D组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。此外，A、B、D组与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2、图2。

表2 各组PTENmRNA半定量灰度值比较（）

表2 各组PTENmRNA半定量灰度值比较（）

a：P＜0.05，与 A组比较；b：P＜0.05，与B组比较；c：P＜0.05，与D组比较。

48 0.54±0.13 B组 27 0.59±0.16 C组 19 0.97±0.16ab D组 14 0.92±0.13ab正常对照组 20 1.10±0.16灰度值A组组别 n abc

图2 各组PTENmRNA半定量灰度值

3 讨 论

本研究结果提示，β－catenin基因的高表达率可能与AFB1高暴露有关。AFT是寄生曲霉、黄曲霉等真菌的代谢产物，根据其细微结构的不同可分为B1、B2、G1、G2、M1、M2等多种化合物，化学结构类似，在环境中广泛存在，尤其在高温潮湿地区的霉变食品中［8］。研究发现，AFB1的毒性最强且对肝的致癌性最大［9］。AFB1致癌的可能机制是DNA损伤引起抑癌基因p53和癌基因ras突变，DNA损伤后DNA上出现碱基突变或碱基空缺，使p53的DNA复制及转录过程受阻［10］。

本研究发现AFB1高暴露组的β－catenin基因表达率显著高于其他各组，C组的表达趋势高于B组，作为单独因素存在时，AFB1的效应要高于 HBV，而β－catenin表达在A组中最高，则提示当两种因素同时存在时，对β－catenin表达可能具有协同效应。Tien等［11］的研究发现癌细胞高及中分化的HCC中β－catenin 显著增高，与本研究结果一致。Wnt／β－catenin 信号通路与肿瘤形成有关，通过转录翻译后修饰激活靶基因启动肝癌再生程序［12－13］。β－catenin 基因的高表达率可能是β－catenin在细胞膜的积聚影响细胞间的黏附，进而影响HCC的发生、发展。

在本研究中，在HBV高感染组中，PTEN基因的mRNA表达半定量灰度值低于其他各组，提示PTEN基因失活与HBV高感染率有关。PTEN是继p53及Rb之后发现的重要抑癌基因，在多种恶性肿瘤中存在此基因表达降低［14－15］，PTEN在细胞内的主要作用机制是影响细胞内蛋白质磷酸化水平，通过其脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶发挥作用，PTEN低表达促使肿瘤发生、发展。本研究中运用RT－PCR技术检测PTENmRNA表达的半定量灰度值在A组与B组中要显著低于C组与D组。而前两组的共同点均为HBV感染阳性。由此本研究推断HBV的感染是导致PTEN基因失活的因素之一，HBV的影响途径可能是通过引起PTEN的缺失来降低PTEN基因的表达。HBV／AFB1双暴露的HCC中，PTEN的表达水平明显下降，推断与HBV和AFB1具有协同作用有关，而PTEN基因的表达下调则可能主要与HBV感染有关，AFB1对PTEN基因的表达下调可能有辅助协同作用。

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