SHR大鼠左室肥厚与室性心律失常发生的相关性研究

黄 颖，伍伟锋

（1.广西壮族自治区民族医院心血管内科二病区，广西南宁 530001；2.广西医科大学第一附属医院心血管病研究所，广西南宁 530021）

临床研究已明确，约30%高血压患者有左室肥厚（left ventricular hypertrophy，LVH），这类患者的心血管病病死率较无 LVH 的高血压患者高8倍（16%vs.2%）［1－2］，一个十分重要的原因在于前者容易发生室性心律失常（ventricular arrhythmia，VA），但与之相关的基础性研究较少，特别是有关SHR大鼠LVH与VA发生关系方面，目前尚无报道。Langendorff灌注是采用恒压或恒流方式从主动脉根部逆向用含氧灌流液灌流，保持哺乳动物离体心脏存活从而对VA动物模型观察心功能的方法，排除了神经、体液因素和心脏前后负荷等对实验的影响。本研究旨在通过观察SHR大鼠和对照大鼠的离体心脏在Langendorff灌注低钾液时诱发VA的敏感性差异，从动物实验角度为LVH在高血压患者诱发VA中的作用做进一步验证。

1 材料与方法

1.1 主要材料 7周和15周的雄性SHR大鼠（由上海斯莱克实验动物中心提供），用尾袖法连续无创测鼠尾动脉压1周，时间均固定于8：00～14：00，每只大鼠在其安静状态下测量血压3次，随机取血压平均值超过正常上限的大鼠各12只入组，分为16周高血压的LVH组和8周高血压无LVH的非LVH对照组，另购15周雄性Wistar大鼠12只连续测压1周确定血压在正常水平后作为空白对照组。Masson染色试剂盒（上海生工）；Langendorff离体心脏灌流系统、ALC－B5恒流泵、MPA－心功能分析系统（上海奥尔科特生物科技有限公司）；MS4000U生物信号定量记录分析系统（广州市龙飞达科技有限公司）；XD－2A型心脏电生理诊疗仪（苏州东方电子仪器厂）；针灸针电极，自制。本实验所需其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 Langendorff离体心脏灌注 用木锤击昏动物后，迅速将心脏连同一段主动脉取出，将主动脉套进心脏插管口内固定。心脏经充氧的温K－H液（以95%O2＋5%CO2混合气饱和，恒温37 ℃，NaCl 6.92g／L，KCl 0.35g／L，CaCl20.28 g／L，MgSO4·7H2O 0.29g／L，KH2PO40.16g／L，NaHCO32.1g／L，葡萄糖2.0g／L，pH 7.4）预灌流。将2个电极分别置于心脏心尖部和主动脉根部，连接多道生物信号记录仪。首先灌流K－H液20min后，灌入低钾液（KCl 0.175g／L，其余同普通K－H液）60min（除非持续时间大于2min的SVF提早出现），同时记录心脏心室内压和流出液，心电示波器全程监测并记录心电图（ECG），观察各组发生心律失常的情况。参照心律失常评分标准［2］进行评分，并参照文献［3］剔除不合格样本。

1.2.2 大鼠心肌组织病理学检查 将大鼠离体心脏用生理盐水冲洗吸干，将左心室游离壁心肌组织固定于10%甲醛液中作常规石蜡切片，苏木素－伊红（HE）染色后镜检以检测大鼠心肌组织病理学改变。

1.2.3 大鼠心肌组织Masson染色观察左室心肌间质纤维沉积 5μm组织切片；常规脱蜡；苏木素染色2min，水洗；1%盐酸乙醇分化，流水冲洗10min；丽春红酸性品红染5min，水洗。1%磷铝酸处理1min；2%苯胺蓝染1min，1%冰醋酸浸洗1min；95%乙醇快速滴洗3次；常规脱水、透明、封片；光镜观察。计算心肌组织胶原纤维面积占整个组织面积的百分比，即胶原容积分数（CVF）＝胶原面积／总面积，所有标本均取3个视野测量，计算其均值。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料以表示，多组间比较采用方差分析（ANOVA），组间两两比较采用ANOVA中的q检验法；计数资料采用Fisher确切概率法检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Langendorff离体心脏灌注各指标比较 Langendorff灌注标准K－H液过程中，各组心率未见明显差异（P＞0.05）；灌注低钾液1～5min后各组心率有所降低。灌注低钾液后，室性心动过速（ventricular tachycardia，VT）、室性早搏（ventricular premature beat，PVB）出现时间早于短暂室颤（transient ventricular fibrillation，TVF）或持续性室颤（sustained ventricular fibrillation，SVF）。灌流低钾液后，LVH组开始出现VA的时间明显早于非LVH对照组和空白对照组（P＜0.05）。随后，LVH组出现SVF的时间（8min后）也明显早于非LVH对照组和空白对照组（18min后）。LVH组的VA评分与非LVH对照组和空白对照组相比较均显著增高（P＜0.05），见表1。

表1 Langendorff离体心脏灌注各指标比较

续表1 Langendorff离体心脏灌注各指标比较

2.2 大鼠心肌组织病理变化 空白对照组表现为大鼠左心室心肌纤维间质和细胞形态大小接近正常，胞浆染色均匀。LVH组大鼠的心肌细胞间质增多，心肌纤维可见溶解断裂，细胞明显肥大。非LVH对照组病理改变介于LVH组和空白对照组之间。

2.3 Masson染色观察左室心肌间质纤维沉积 LVH组心肌内胶原组织明显增多，围绕心肌细胞的胶原纤维网断裂、排列紊乱；空白对照组肌间隙很窄，无明显胶原组织分布，相邻细胞的胶原纤维网完好，着色淡；非LVH对照组介于LVH组和空白对照组之间。LVH组（0.30±0.05）与非LVH对照组（0.10±0.03）、空白对照组（0.08±0.03）比较，CVF明显增高（P＜0.05），表明LVH组大鼠左心室出现了明显重构现象，与非LVH对照组、空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），非LVH对照组和空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨 论

多项临床研究证明，伴有LVH的高血压患者容易引发VA，从而增加心血管事件尤其是猝死风险。Fialová等［4］对由L－NAME诱导的高血压大鼠和SHR大鼠2种模型的Langendorff离体心脏灌注低钾液后发现，室颤发生率均明显高于正常对照组（83.3%vs.62.5%vs.25%～33.3%），并伴随着连接蛋白43（Cx43）表达降低。作者由此认为，由高血压介导的缝隙连接重构是促使恶性VA发生的重要因素，这为本研究提供了先证。

高血压左室重构主要表现为LVH和心肌纤维化，而LVH即心肌细胞肥厚主要表现为心肌细胞体积的增大和“胎儿化表型”的出现。SHR大鼠的病理生理状态与人类原发性高血压非常接近，5～6周龄时开始逐渐出现血压增高，14～16周龄时LVH已明确形成并逐渐进展，是应用于高血压发病机制研究的理想动物模型。本研究采用Langendorff低钾液灌流对SHR大鼠以及正常大鼠的左室心肌组织进行VA的诱发后发现，LVH组大鼠心肌间质增多，心肌细胞明显肥大。LVH组大鼠心脏在灌流低钾液后发生各种VA的概率明显高于非LVH对照组和空白对照组，提示K＋紊乱更容易促使LVH心肌诱发恶性心律失常，与Tribulova等［5］研究结论相一致。可能的机制为［6］：肥厚心肌增加了细胞兴奋性和传导性，纤维化和灶性肌溶坏死使局部心肌细胞电活动不稳定而产生折返环、室壁肥厚、耗氧量增加导致心肌复极的延缓及离散等。在此病理基础上由低钾液灌流引发急性电生理失衡时，细胞外K＋浓度降低，依赖于膜电位的快钠通道失活，进一步恶化LVH所致心肌病理改变，导致心肌产生钙超载［7－8］。后者能够激活Ca2＋依赖的蛋白酶Calpains而导致溶酶体释放［9］，还可促使Cx43降解增加［10］。而Cx43是哺乳动物心肌缝隙连接中主要的连接蛋白之一，其数量和分布的异常正是多种VA发生的解剖学基础［11］。

另一方面，本实验发现，随着低钾液灌注时间的延长，LVH组与非LVH对照组、空白对照组比较，大鼠离体心脏在低钾液灌注后明显易感恶性VA，且VA发生严重程度更高，起始时间更早，持续时间更久，见表1。由此说明，LVH不仅与心血管事件密切相关，而且还可能是急慢性心血管事件（如急性低钾血症）引发VA的重要背景环境，甚至可能作为心血管事件重要的预测指标。在此之前，Kannel等［12－13］就观察到，当个体在心脏超声下确诊LVH时，总病死率增加5倍，心血管事件病死率增加8倍，男性和女性的猝死率各增加6倍和3倍。在另一项多因素分析研究中［14］，有人指出男性患者左心室体积每增加50g／m2，心血管疾病死亡的相对风险指数就增加1.73，而女性数值为2.12。Martins等［15］也发现，将22只正常血压和18只慢性高血压伴有LVH的犬进行左前降支冠状动脉结扎术3h后，在存活下来的8只LVH犬中有7只和8只无LVH的正常血压犬中出现持续性单型VA。这些研究也强烈支持本实验观点。

本研究运用Langendorff低钾液灌流SHR大鼠LVH离体心脏模型，结果显示伴有LVH的SHR大鼠VA的发生概率和严重程度较无LVH的SHR大鼠明显增加，提示LVH与VA的发生密切相关，LVH可能正是高血压负荷下急慢性心血管事件引发VA的必要背景环境，进一步地确证了临床上认为伴有LVH的高血压患者的VA发生率较无LVH的高血压患者明显增高的观点，为VA发生的分子机制研究提供了可靠的数据基础。

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