尿核基质蛋白22和细胞角蛋白20mRNA联合监测在膀胱肿瘤复发中的意义＊

朱 峰，张 艳，李 军，贾安奎，艾 芳，刘 沛，张会清△

（1.新乡医学院第一附属医院泌尿外科，河南卫辉 453100；2.新乡医学院第三附属医院泌尿外科，河南新乡 453001；3.新乡医学院生理学教研室，河南新乡 453001）

膀胱肿瘤是泌尿外科最常见的肿瘤，高复发率是其特征之一［1］，故术后监测为其有效治疗、改善预后和提高长期生存率的重要环节。目前，膀胱镜检查及尿细胞学检查仍是长期随访的金标准［2］。尿细胞学检查虽为无创且特异度较好，但敏感度较低，尤其是对低分级分期的肿瘤。膀胱镜检查目前诊断效能最佳，但其缺点为侵入性检查，具有一定痛苦，患者长期依从性差。因此，寻找非侵入性、特异度和敏感度均佳的膀胱肿瘤标志物，对肿瘤复发监测具有重要的临床价值。作者通过联合检测尿核基质蛋白22（nuclear matrix protein 22，NMP22）和细胞角蛋白20（cytokeratin 20，CK20），探讨二者在膀胱肿瘤复发监测中的临床应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 在排除合并泌尿系感染、结石、异物、肠道代膀胱、其他泌尿系肿瘤及近2周内曾行泌尿系器械操作和膀胱灌注患者［3］后，将新乡医学院第一附属医院2007年9月至2009年8月常规复查的膀胱尿路上皮癌术后复查患者112例纳入研究，以膀胱镜检及病理学检查为金标准，分成复发组和未复发组。（1）复发组：46例，男38例，女8例，年龄21～91岁，平均61.8岁。确诊为复发后均行手术治疗，术后经病理科核实为膀胱尿路上皮癌。病理分级按照WHO标准：G124例，G215例，G37例；临床分期按国际抗癌联盟TNM标准：Tis～T131例，T2～T415例。（2）未复发组：66例，男54例，女12例，年龄23～81岁，平均60.4岁。（3）另将健康志愿者40名作为健康对照组纳入研究。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 NMP22试剂盒（R＆D），总RNA提取试剂盒及PCR试剂盒（TransGen），RNA later保存液（Ambion）。采用Primer Premer软件自行设计引物，引物序列如下：CK20外引物，正向引物：5′－TCT TTG ATG ACC TAA CCC TAC－3′；反向引物：5′－TTT CTT CCA CCT CTT TGA CT－3′，产物大小732bp；内引物，正向引物：5′－TCC CAG AGC CTT GAG ATA GA－3′；反向引物：5′－GAC TTC AGA TGA CAC GAC CTT－3′，产物大小375bp；β－actin引物，正向引物：5′－CTG GGA CGA CAT GGA GAA AA－3′；反向引物：5′－AAG GAA GGC TGG AAG AGT GC－3′，产物大小564bp。

1.2.2 主要仪器 全波长扫描酶标仪（美国Thermo Scientific Multiskan Spectrum型），高速低温离心机（美国Thermo Scientific CL31R型），PCR仪（美国 Applied Biosystems），电泳仪（中国北京市六一仪器厂DYY－6C型）。

1.3 方法

1.3.1 标本收集与保存 收集膀胱镜检前复查患者和健康志愿者清洁中段晨尿约200mL，分为2份。5mL离心（1000 r／min，10min），取上清液1mL置于1.5mL EP管中，迅速置入－80℃冰箱中保存，用酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测NMP22；其余尿液低温离心（4℃，3000r／min，20min）得到尿脱落细胞，RNA later保存液悬起后转入2mL冻存管，置室温1h后保存于－20℃冰箱中（仍保持液态），用于检测CK20 mRNA的表达。

1.3.2 NMP22检测 采用ELISA法定量检测尿NMP22，实验步骤完全按照试剂盒说明书进行，建立标准曲线（图1）计算出对应的NMP22含量，以6U／L为诊断肿瘤复发的临界值。

1.3.3 CK20mRNA检测 将RNA later保存液低温离心后，留取沉淀，提取总RNA。用紫外分光光度计测定总RNA深度和纯度，OD260／OD280在1.6～2.0之间，并用0.8%琼脂糖凝胶检测其完整性，清楚地显示出3条28、18、5s的条带。取总RNA 8μL，按试剂盒中说明配成20μL体系。短暂离心后放PCR仪上42℃孵育30min，85℃加热5min得cDNA。取2μL cDNA进行后续巢式PCR反应，第一次PCR反应体系为50μL；引物为CK20外引物；反应条件为94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共20个循环；72℃总延伸6min。第二次PCR及内参PCR的反应体系及反应条件基本同第一次，引物分别为CK20内引物、β－actin引物，共30个循环。取5μL扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，电压4～10V／cm，电泳20～30min，在紫外线投射仪下观察电泳条带并照相。

1.4 结果判断 尿NMP22临界值为6U／L，小于6U／L为阴性表达，反之为阳性表达。尿脱落细胞RNA检测以内参βactin电泳出现564bp条带证明上皮细胞的存在和RNA的稳定性；以同时出现375bp条带和564bp内参电泳条带为CK20mRNA阳性，仅出现564bp内参电泳条带为CK20mRNA阴性，两条带均不出现者视为RNA降解，弃去不用。联合检测CK20mRNA与NMP22时一项或两项为阳性时计为阳性，两项同时阴性时计为阴性。

1.5 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行统计学处理，率的比较采用χ2检验或Fisher精确概率法检验分析。NMP22、CK20单独、联合二者检测与病理诊断进行一致性检验（Kappa值），同时考查其敏感度、特异度、阳性预测率、阴性预测率和Youden指数。检验水准α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NMP22和CK20mRNA在复发组、未复发组及健康对照组中的表达 健康对照组尿中NMP22和CK20mRNA表达均为阴性，复发组尿中NMP22和CK20mRNA的阳性表达率分别为78.3%（36／46）、80.4%（37／46），未复发组 NMP22和CK20mRNA的阳性表达率均为6.1%（4／62），复发组阳性表达率明显高于未复发组，差异有统计学意义（P＜0.05）；未复发组与健康对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 NMP22和CK20mRNA在复发膀胱肿瘤尿液中的表达与临床病理特征之间的关系 NMP22的表达与病理学分级和临床分期有关（P＜0.05），而与年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤数目无关（P＞0.05）。CK20mRNA的表达与肿瘤数目有关（P＜0.05），而与年龄、性别、肿瘤直径、病理学分级和临床分期无关（P＞0.05），见表1。

2.3 NMP22、CK20mRNA单独检测与联合检测在膀胱肿瘤复发中的意义 NMP22监测膀胱肿瘤复发的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和Youden指数与临床诊断一致性检验的Kappa值为0.75（P＜0.05）；CK20mRNA监测膀胱肿瘤复发的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和Youden指数与临床诊断一致性检验的Kappa值为0.77（P＜0.05）；联合CK20与NMP22监测膀胱肿瘤复发的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和Youden指数与临床诊断一致性检验的Kappa值为0.88（P＜0.05）。NMP22、CK20mRNA单独检测与联合检测灵敏度比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表1 尿CK20mRNA、NMP22在复发膀胱肿瘤中的表达与临床病理特征之间的关系

表2 NMP22、CK20mRNA单独监测与联合监测膀胱肿瘤复发的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和Youden指数（%）

3 讨 论

3.1 NMP22检测在膀胱肿瘤复发监测中的价值 人上皮细胞中发现的NMP22属于核基质蛋白家族中的一种，于1980年由Lydersen等［4］首次发现并命名，其主要功能为协调细胞增殖核有丝分裂期间遗传物质正确、均等地分配到子代细胞。NMP22多分布于细胞有丝分裂较为活跃的组织，而恶变时细胞有丝分裂极度活跃。国外研究发现，NMP22检测在膀胱肿瘤的检测中具有高效、快捷等优点，且具有较高的敏感及特异度［5－6］；Kehinde等［7］认为 NMP22监测可作为膀胱肿瘤或高度怀疑膀胱肿瘤患者早期监测的金标准。研究发现，NMP22在膀胱复发肿瘤中的检测相对于尿脱落细胞学检测具有较高的敏感度及特异度，且对于膀胱肿瘤复发的预测具有明显优势［8］。Smrkolj等［9］研究认为，NMP22的检测相对尿细胞学检测具有较高的敏感度，但特异度稍低，不能作为替代膀胱肿瘤患者术后的膀胱镜检查。Shariat等［10］研究认为，NMP22监测不能替代膀胱镜检查，但可以帮助判断哪些患者需要行膀胱镜检查，有效地减少膀胱镜检查次数。另有研究表明，膀胱肿瘤术后随访膀胱镜检查阴性而尿NMP22检测阳性的患者，有高复发风险，应加强术后监测随访［11］。本研究表明，NMP22在复发组中的表达率明显高于未复发组及健康对照组（P＜0.05）；在复发膀胱肿瘤尿液中，NMP22表达率与性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤数目无关（P＞0.05），与肿瘤细胞的分化和进展程度有密切关系。从低级别、非浸润性肿瘤到高级别、浸润性肿瘤的发展中，NMP22的表达逐渐增强。

3.2 CK20mRNA检测在膀胱肿瘤复发监测中的价值 CK由角蛋白基因编码、分布于外胚层起源细胞中，是上皮细胞发生、分化、成熟过程中逐渐形成的，是所有哺乳类动物细胞骨架的中间丝之一，参与构成细胞骨架。CK20由Keesee等［12］于1990年发现，含424个氨基酸，相对分子质量为48.5×103，等电点为5.66，属酸性CK。CK20的分布特点和表达方式，使其应用于膀胱肿瘤的病理分型、组织来源鉴别和转移的监测［13］。本研究显示，CK20mRNA在监测肿瘤复发中有较高的敏感度和特异度，可以作为膀胱肿瘤复发的指标，而且其敏感度在低级别非浸润性复发肿瘤与高级别浸润性复发之间差异无统计学意义（P＞0.05），有利于复发肿瘤的早期检出，CK20mRNA阳性还提示复发肿瘤为多发的可能性，在膀胱镜检查中应注意观察，减少漏诊概率，这与Eissa等［14－15］研究结论一致。

3.3 联合检测NMP22与CK20mRNA在膀胱肿瘤复发监测中的价值 随着新型膀胱肿瘤瘤标志物的不断出现，几种肿瘤标志物的合理联合应用成为诊断膀胱肿瘤的有效工具［16］。本课题考虑到CK20mRNA位于完整脱落细胞内，可通过尿液离心获得尿脱落细胞，而NMP22是脱落细胞凋亡后细胞核裂解释放于尿液中的可溶性蛋白，可直接检测尿液。这样既检测了完整的脱落细胞，又检测了凋亡的脱落细胞，二者联合应用具有互补性。本研究显示，联合检测NMP22与CK20mRNA在未明显降低特异度的基础上，大大提高了诊断的敏感度。其特异度与尿细胞学检测相差较小，而敏感度却远高于尿细胞学检测，因而联合检测较单一指标的检测对膀胱肿瘤复发监测具有更高的诊断价值。其次，NMP22检测方法简单，可以在一般实验室里进行，而RT－PCR检测也是实验室常用的方法。因此，作者认为，联合检测NMP22与CK20mRNA因其无创且敏感度、特异度较高，可用于膀胱肿瘤复发监测，阴性患者继续观察，阳性患者再行膀胱镜检查，减轻患者痛苦。但联合检测NMP22与CK20mRNA仍不能完全替代膀胱镜检查，需要进一步研究以寻求更为理想的膀胱肿瘤标志物。

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