硫酸锌预处理对大鼠缺血再灌注心肌Cx43及再灌注室性心律失常影响

马 赫，李若凡，张 钊，姚天明

1.第四军医大学学员旅，陕西 西安 710032；2.沈阳军区总医院，辽宁 沈阳 110016

锌是人体内代谢必需的微量元素之一，在促进生长发育、调节机体代谢及维持人体正常生理功能中发挥着重要的作用[1]。缝隙连接是细胞间信号传递的结构基础，在心脏电传导活动中发挥着重要的作用[2]。心肌同步收缩的结构基础闰盘中大量分布缝隙连接蛋白(connexin Cx)，其中心室肌缝隙连接蛋白主要由Cx43构成[3]。临床研究发现，心律失常患者血清锌水平显著降低，且随着病程的延长，降低水平逐渐显著[4]。动物实验也证明，硫酸锌可以减少缺血再灌注后心肌细胞损伤，起到保护心肌的作用[5,6]。然而硫酸锌预处理对再灌注心律失常发生的影响及机制仍存在争议。有研究显示，缝隙连接的结构和功能变化会引起电脱偶联，也是室性心律失常发生的重要因素，缝隙连接通道的关闭是电冲动传导缓慢及异常传导的基础[7-9]。已有研究显示，缺血早期缝隙连接的关闭过程中有Cx43的去磷酸化发生[10,11]。本文通过建立大鼠心肌缺血再灌注模型，探讨硫酸锌预处理对大鼠再灌注心律失常发生和Cx43磷酸化水平的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 小鼠抗大鼠总Cx43(T-Cx43)一抗、兔抗大鼠磷酸化Cx43(p-Cx43)一抗均购自美国ABcam公司；小鼠抗Tubulin单克隆抗体、HRP羊抗小鼠二抗、HRP羊抗兔二抗购自美国Sigma公司。

1.2 动物分组及建立模型

1.2.1 动物分组 雄性成年SD大鼠，体重250～280 g(第四军医大学实验动物中心提供)。随机分为4组，每组6只。(1)假手术+生理盐水预处理组(Sham+Sa组):前股静脉注射等量生理盐水，开胸后只穿线不结扎血管，麻醉维持90 min；(2)假手术+硫酸锌预处理组(Sham+Zn组)：开胸缺血前10 min经股静脉注射硫酸锌溶液8 mg/kg，余同Sham+Sa组；(3)缺血再灌注+生理盐水预处理组(I/R+Sa组)：开胸前股静脉注入等量的生理盐水，缺血30 min，再灌注60 min；(4)缺血再灌注+硫酸锌预处理组(I/R+Zn组)：开胸前股静脉注入硫酸锌溶液8 mg/kg，缺血30 min，再灌注60 min。

1.2.2 建立模型 SD大鼠以戊巴比妥钠麻醉后，取仰卧位固定，用针形电极插入其四肢皮下，连续监测Ⅱ导联心电图变化。对大鼠行气管插管，连接微型动物呼吸机后，于胸骨左缘3～4肋间开胸，逐层分离暴露心脏，分离心包，于冠状动脉左前降支距左心耳下缘2 mm处穿针，两线头共同穿过一直径为3 mm的乳胶管，轻提丝线并推下套管动脉夹夹闭造成心肌缺血，松开动脉夹形成再灌注。心电图ST段抬高，结扎线以下部位心肌颜色变暗为心肌缺血标志，再灌注后ST段回落，心肌缺血区由暗红色转为红色，表示再灌注成功。

1.3 心电图观察指标及评分方法 观察心电图Ⅱ导联再灌注60 min内心电图ST段及QRS波变化，以改良的Curtis 和 Ravingerova评分方法评分。1分：ST段抬高或QRS波增宽；2分：偶发室性早搏(VE)；3分：成对VE、VE二联律三联律或VE≥5次；4分：频发VE(1min内≥5次)；5分：<30 s室性心动过速(VT)；6分：≥30 s室性心动过速；7分：心室颤动(VF)多次累计>30 s；8分：VF连续<5 min；9分：VF多次累计<5 min或一次≥5 min；10分：VF多次累计>5 min。

1.4 心肌标本的取材及冻存 实验结束后，即刻取动物心脏，取结扎冠状动脉左前降支以下的整层心肌，磷酸盐缓冲液(PBS)洗净表面血液后滤纸吸干后放入液氮中冻存，随后取出放入-80 ℃冰箱保存。

1.5 Werstern-Blot检测 将冻存的心肌组织块研磨匀浆后，用裂解液提取组织蛋白，进行蛋白定量，12%分离胶和5%浓缩胶上样电泳后，将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，3%牛血清白蛋白(BSA)封闭1 h，分别加入小鼠抗T-Cx43蛋白单克隆一抗、小鼠抗p-Cx43蛋白一抗和小鼠抗Tubulin一抗4 ℃孵育过夜，洗膜6次，每次5 min。室温下孵育相应二抗1.5 h，同前洗膜，显影液发光分析结果。

2 结 果

2.1 4组大鼠心电图检测结果 I/R+Sa组有4只发生VT，其中1只VT<30 s，1只VT一阵≥30 s，2只VF多阵累计>30 s；5只发生VE，其中3只为频发，2只为偶发，6只均有明显的ST段抬高及QRS波增宽。Sham+Sa组及Sham+Zn组无VT发生，各有3只出现ST段抬高或QRS波增宽，Sham+Sa组有1只出现偶发VE；I/R+Zn组有3只出现VT，均为<30 s，1只出现频发VE，2只出现偶发VE，程度均较I/R+Sa组减轻，5只出现ST段抬高或QRS波增宽。以改良Curtis 和Ravingerova评分方法评分，Sham+Sa组为(0.833±0.307)分，Sham+Zn组为(0.500±0.224)分，I/R+Sa组为(7.833±0.946)分，I/R+Zn组为(4.667±0.558)分。

2.2 Western-Blot检测结果 4组T-Cx43、p-Cx43及Np-Cx43均有表达。与Sham+Sa组及Sham+Zn组相比，I/R+Sa组T-Cx43及p-Cx43蛋白表达水平降低(P<0.01)，I/R+Zn组T-Cx43及p-Cx43蛋白表达水平升高(P<0.01)，与Sham+Sa组及Sham+Zn组相近(P<0.01)。见图1，图2。

注：p-Cx43：磷酸化Cx43蛋白；Np-Cx43：非磷酸化Cx43蛋白；Tubulin：内参蛋白。图1 各组Cx43表达和磷酸化检测结果

注：T-Cx43：总Cx43；p-Cx4：磷酸化Cx43。与Sham+Sa组比较，a P<0.01; 与I/R+Sa组比较，b P<0.01。图2 各组Cx43表达和磷酸化情况

3 讨 论

锌是体内代谢必需的微量元素之一，在促进生长发育、增强人体免疫力、调节各种酶的活性及受体等方面发挥重要的作用[12]。临床研究发现，冠心病、心肌梗死等患者体内的微量元素锌水平显著降低[13-15]。有研究表明，锌可对坏死的心肌起到保护作用，其作用与硝酸甘油及普萘洛尔相似，但作用较弱[5]。在多项动物实验中，锌对实验性心律失常的作用得到肯定。然而锌预处理对缺血再灌注心律失常的作用仍然存在争议，而其抗心律失常作用是否与调节Cx43有关仍未得到证实。

Cx43与心律失常的发生关系密切，尤其是致命性室性心动过速及室颤，均与心室肌中Cx43的重构有关[16,17]。Gutstein等[18]研究证实，敲除心脏Cx43基因的大鼠，心室传导速率明显减慢，并有引起心源性猝死的可能。Kieval等[19]研究也发现，缺血再灌注心肌中Cx43的表达减少，其分布也发生改变，生理状态下其主要在闰盘呈现簇状分布于端端连接处，而心肌梗死后，其主要分布于侧侧连接处。以上研究均表明，Cx43的表达和分布变化可以影响心室肌的电传导活动，并在室性心律失常的发生中发挥重要作用。

本实验主要研究硫酸锌预处理对大鼠缺血再灌注后心律失常发生的影响及其对Cx43表达的影响。在成功建立大鼠缺血再灌注模型后，通过硫酸锌预处理，观察大鼠再灌注后心律失常发生情况。研究发现，硫酸锌预处理可以显著降低大鼠再灌注心律失常发生的程度，可以在一定程度上防止恶性心律失常的发生，降低死亡风险。为进一步探讨其作用机制，本实验对Cx43的表达及磷酸化水平进行检测。结果发现，缺血再灌注后Cx43的表达水平及磷酸化水平均有明显降低；给予硫酸锌预处理后，其表达和磷酸化水平升高并与Sham+Sa组及Sham+Zn组相近。磷酸化是蛋白转录后的一种常见的修饰方式，连接蛋白中大部分都需经磷酸化修饰后表现活性。机体通过调节蛋白激酶和蛋白磷酸化酶的相互作用，控制许多细胞内过程，包括连接蛋白的转运、组装、解离等[20]。本实验结果表明，生理状况下Cx43主要以磷酸化水平存在，在缺血再灌注损伤后，心室肌Cx43的表达量下降，磷酸化Cx43含量也显著降低，表达含量的降低和磷酸化水平的降低导致心肌组织的阻抗增加、电导性下降，出现缝隙连接的电脱耦连现象，导致折返性电活动的发生，最终引起严重的室性心律失常[21]。硫酸锌预处理后，Cx43的表达及磷酸化水平均有提高。Cx43的表达和磷酸化检测结果与心律失常评分结果一致，也进一步证明了Cx43在缺血再灌注心律失常中的作用，以及硫酸锌可以通过影响Cx43的表达减低缺血再灌注心律失常发生的频率及程度。

本实验结果提示，缺血再灌注后大鼠的心律失常发生率明显上升，而硫酸锌预处理可以显著降低心律失常发生率及程度，其作用机制可能与硫酸锌调控缺血再灌注后Cx43表达及磷酸化水平有关。然而Cx43的分布也可能影响缺血再灌注心律失常的发生，硫酸锌是否可能通过影响其分布改善缺血再灌注心律失常的程度，硫酸锌如何调控Cx43的表达及磷酸化水平仍有待进一步探讨。

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