化学合成小干扰RNA对大鼠脑内AQP4蛋白沉默效果验证与筛选

宋振全，赵 旭，，刘恩智，柳云恩，张 兴，张海松，单提坤，赵 航

1.沈阳军区总医院神经外科，辽宁 沈阳 110016；2.辽宁医学院研究生学院，辽宁 锦州 121001；3.沈阳军区重症(战)创伤实验室，辽宁 沈阳 110016

脑水肿是创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)后的基本病理过程之一，也是致残、致死的重要因素之一[1]。研究发现，水孔通道蛋白4(aquaporin4，AQP4)与脑水肿的发生发展有着紧密的联系[2,3]。将序列特异性双链RNA (dsRNA)导入机体，使细胞内同源mRNA降解，产生特异的基因沉默，这种现象被称为RNA干扰(RNA interference，RNAi)。有研究利用RNA干扰技术，设计合成靶向AQP4的RNA片段，通过有效的细胞转染，对AQP4进行基因表达沉默，可以有效地抑制脑水肿的发生发展[4]。临床研究认为，创伤性脑水肿的早期治疗最为关键，但损伤早期的机制十分复杂，有必要找出一种快速有效地抑制AQP4蛋白的方法，以便于研究脑水肿初期损伤的机制和指导临床用药。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物分组 健康成年雄性Wistar大鼠18只，体重250～300 g。由沈阳军区总医院动物实验中心提供[实验中心许可证号SYXK(军)2002-019][动物许可证号SCXK(军)2002-0174]，大鼠自由获得食物及水，在14 h/10 h的照明/熄灯周期条件下喂养。实验动物按随机数字表法分为注射阴性对照液组、注射725链组和注射1006链组。

1.1.2 主要试剂及仪器 根据分析软件设计并筛选出2条大鼠AQP4siRNA链，分别为：大鼠小干扰RNA(Aqp4-rat-725：5′GCAGUUAUCAUGGGAAACUTT 3′，5′AGUUUCCCAUGAUAACUGCTT 3′)；(Aqp4-rat-1006：5′CUCGUCUGGAGAGGUAUUATT 3′，5′UAAUACCUCUCCAGACGAGTT 3′)(上海吉玛公司设计并制备)。AQP4siRNA浓度为10 μmol/L，是将0.25 OD siRNA溶于20 μL 焦磷酸二乙酯(DEPC)水中配得。兔抗鼠AQP4抗体(BA1560， 武汉博士德公司)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG (St.Louis，MO，北京中杉公司)；AQP4原位杂交检测试剂盒(武汉博士德公司)。

主要仪器有：Olympus荧光显微镜IX71(日本东京)；SR-6R大鼠脑立体定向仪(日本东京三菱公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 立体定向脑室内给药 采用水合氯醛350 mg/kg腹腔内注射麻醉，俯卧位固定，头部备皮、消毒。于前囟后约1.0 mm，以中线旁开1.5 mm为中心，以磨钻磨一骨窗，直径约2 mm，显露硬脑膜。以微量注射器自骨窗中心脑表面垂直进针3.5 mm，向脑室内缓慢注射(约5 min)AQP4siRNA或阴性对照液20 μL，等待3～5 min后缓慢退针(约2 min)。

1.2.2 各实验组处理 3月龄雄性Wistar大鼠，按照随机数字表法将其分为：注射阴性对照液组、注射725链组和注射1006链组。各组分别经过脑室注射阴性对照液、725链siRNA或1006链siRNA。

1.2.3 一般情况观察 大鼠苏醒后观察精神、饮食、运动及肢体运动改变情况。

1.2.4 灌注、取材及包埋 大鼠麻醉后，显露心脏，左心室插管后剪开右心耳，快速灌注4%多聚甲醛200 mL，直至流出液体清亮；灌注完毕后取全脑，冠状切取损伤中心脑组织， 置于4%多聚甲醛中浸泡固定4 h；经梯度酒精脱水，二甲苯透明，进行石蜡包埋。

1.2.5 AQP4蛋白免疫组织化学观察 石蜡切片预处理后滴加1∶200免抗鼠AQP4多克隆抗体，阴性对照组标本加入等量抗体稀释液，37 ℃孵育2 h；滴加1∶100/磷酸盐缓冲液(PBS)生物素化抗体，37 ℃孵育30 min；滴加1∶100/PBS 链霉亲和素-生物素复合物(SABC)，37 ℃孵育30 min。通过图像分析软件计算全脑单位面积的AQP4免疫阳性强度。

1.2.6 原位杂交方法检测AQP4 mRNA的表达 石蜡切片经预处理后，通过AQP4原位杂交试剂盒鉴定AQP4mRNA的表达，二氨基联苯胺(DAB)显色，显微镜下观察，并通过图像分析软件计算全脑单位面积AQP4mRNA平均阳性强度。

2 结 果

2.1 免疫组织化学结果 注射725链组和注射1006链组AQP4蛋白含量较注射阴性对照液组明显减少，两条siRNA链均能有效减少AQP4蛋白的含量( 图1，表1)。与注射1006链组比较发现，注射725链组对AQP4蛋白含量的抑制效果更加显著。AQP4阳性染色位于星形胶质细胞、室管膜细胞和血管间隙，神经元为阴性。注射725链组和注射1006链组在全脑单位面积的AQP4免疫阳性强度显著低于注射阴性对照液组。其中，注射725链组单位面积AQP4免疫阳性强度显著低于注射1006链组。

表1 各组大鼠脑内AQP4蛋白平均阳性细胞面积

注：与注射阴性对照液组比较，aP<0.05，与注射725链组比较，bP<0.05。

2.2 原位杂交结果 注射725链组和注射1006链组AQP4mRNA含量较注射阴性对照液组明显减少，两条siRNA链均能有效减少脑组织中AQP4mRNA的含量(图2，表2)。与注射1006链组比较发现，注射725链组对AQP4mRNA含量的抑制效果更加显著。AQP4mRNA原位杂交阳性细胞为棕褐色染色，阳性染色位于神经元和星形胶质细胞胞浆。注射725链组和注射1006链组在全脑单位面积的AQP4mRNA阳性强度显著低于注射阴性对照液组。其中，注射725链组AQP4mRNA平均阳性强度显著低于注射1006链组。

注： A：注射阴性对照液组；B：注射725链组；C：注射1006链组。图2 各组大鼠脑内的AQP4mRNA原位杂交染色

表2 各组大鼠脑内AQP4mRNA平均阳性细胞面积

注：与注射阴性对照液组比较，aP<0.05；与注射725链组比较，bP<0.05。

3 讨 论

AQP4蛋白主要存在于中枢神经系统的室管膜上皮细胞、蛛网膜下腔的软脑膜细胞和血管周围的星形细胞等[5,6]，是胶质细胞、脑脊液以及血管之间相互调节和运输水分的重要结构基础[7]。研究证实，AQP4可以易化大脑中细胞内外水分的快速交换，在病理条件下可以导致水分的积累[8,9]。

目前，按照干扰RNA合成方法的不同分为5种，即化学合成法、体外转录法、“鸡尾酒”法、质粒或病毒载体介导的siRNA体内表达和siRNA表达框介导的siRNA体内表达。本实验证实，化学合成法合成的siRNA具有合成方便、起效快和沉默时间较短的特点。而使用病毒或质粒介导的siRNA体内表达无法在数小时内有效沉默目的蛋白。创伤性脑水肿早期损伤的机制十分复杂，治疗很关键，而化学合成法合成的725链siRNA对于AQP4蛋白沉默具有起效快、效率高、时间短的特点，便于研究脑损伤早期治疗时机的选择。

综上所述，脑室给予化学合成的siRNA725链，可以在短期(6 h)内显著降低脑组织中AQP4的mRNA和蛋白质水平，这将更适于脑损伤早期机制的研究，从而进一步指导临床用药。

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