寒凝气滞血瘀证大鼠动物模型的建立及评价

贾丹兵，于淼，李乃民，朱宇，唐立明，李春杰，刘珊，韩玉生，巩沅鑫，魏博

(1.中国人民解放军第211医院，黑龙江 哈尔滨 150080;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

血瘀证是指血液循环迟缓，或流行不畅，甚则血液瘀结停滞成积的病理状态［1］。《内经》认为寒邪和情志失调是引起血瘀证发生的主要致病因素，气血调和，脉道通利是血液正常运行的基本条件。如《灵枢·痈疽》云:“寒邪客于经络之中则血泣，血泣则脉不通。”《灵枢·痈疽》云:“怒则气上逆，胸中蓄积，血气逆流血脉不行。”

寒凝气滞血瘀证动物模型的制作是开展寒凝气滞血瘀证实验研究的重要平台，近年来许多学者研究了有关寒凝血瘀证动物模型的制作，为本领域的研究奠定了一定的基础。本实验从“寒邪”和“气滞”两方面同时入手，通过对三种不同方法制作的大鼠血瘀证模型的比较，探索一种更能接近机体寒凝气滞血瘀证病理过程的动物模型现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

选用清洁级SD大鼠，雄性，体质量(200±20)g，黑龙江中医药大学实验动物中心提供。随机分为4组:A:正常组;B:对照Ⅰ组(分为B1、B2两组);C:对照Ⅱ组;D:模型组(分为 D1、D2两组)。每组各10只，分别编号、标记、称重。

1.2 造模方法

A组正常饲养。B组大鼠置于低温冰柜，在－20℃的冷环境中持续受冻4h，每日1次，连续7日，B1组于第8日观察客观指标并取材检测;B2组于第8日开始常规饲养，第14日观察客观指标并取材检测。C组大鼠皮下注射0.1%盐酸肾上腺素0.08ml/100g，注射2次，间隔4h，第1次注射给药后2h将大鼠置4℃冰水浸泡5min，于第2日观察客观指标并取材检测。D组大鼠在第1日皮下注射0.1%盐酸肾上腺素0.08ml/100g，注射2次，间隔4h，第1次注射给药后2h将大鼠置4℃冰水浸泡5min，于第2日将大鼠分别放入低温冷柜鼠笼中，在－20℃的冷环境中持续受冻4h，每日1次，连续7日，D1组于第9日观察客观指标并取材检测;D2组于第9日开始常规饲养，第15日观察客观指标并取材检测。

1.3 观察指标

1)症状表现:观察造模前后大鼠的症状改变。2)客观指标:各组大鼠分别腹腔注射10%的水合氯醛300mg/100g，统一麻醉成功后，分别测量基础体温(耳温、肛温)。3)血液流变学:腹主动脉取血4ml于肝素抗凝真空采血管中，测定全血高切黏度、中切黏度、低切黏度、血浆黏度。另取全血置于压积管中，3000转离心30min，测红细胞压积。

1.4 统计学处理

采用SPSS 10.0软件统计，数据均以均数加减标准差(s)表示，组间数据显著性差异采用t检验。

2 实验结果

2.1 症状表现

与正常组相比较，各组均出现寒战、打喷嚏、流涕、弓背毛松、口唇鼻耳色紫和饮水增多等表现。B、D组随造模时间延长又表现出明显的唇周发黑，耳色暗红、爪尾部紫暗、畏寒喜暖、踡缩少动、大便稀、食少、体重减轻等症状，其中模型B1、D1组表现最为明显;各组耳廓欠润泽，微血管清晰呈暗红色，其中模型B、D组耳廓明显肿大暗红，微血管紫暗，密度增加，色泽明显加深，肉眼差异显著，而模型C组肉眼差异不明显。

2.2 客观指标

造模前后各组大鼠体温(耳温、肛温)变化:造模前各组间大鼠耳温、肛温相比较，无明显差异(P＞0.05);造模后B、C、D组大鼠耳温、肛温与造模前相比较，除B2组无统计学意义外，均有统计学意义(P＜0.05或 P ＜0.01)，B1、C、D1组体温明显降低。造模后各组间大鼠耳温、肛温相比较，以D1组最低，但无统计学意义(P＞0.05)(结果见表1)。

各组间相比较，造模前后体温降低趋势为:D1组≥B1组≥C组＞D2组＞B2组。

表1 各组大鼠造模前后体温变化(s，n=10)

表1 各组大鼠造模前后体温变化(s，n=10)

注:与同组造模前相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

组别 耳温(℃)肛温(℃)造模前 造模后 造模前 造模后正常 A 组 30.41 ±0.59 30.62 ±0.83 36.44 ±0.51 36.35 ±0.64对照 B1 组 30.55 ±0.88 28.17 ±0.49＊＊36.55 ±0.54 35.01 ±0.68＊＊对照 B2 组 30.21 ±0.52 29.54 ±0.41＊＊36.35 ±0.56 35.85 ±0.53对照 C 组 30.24 ±0.54 28.21 ±0.51＊＊36.50 ±0.58 34.92 ±0.65＊＊模型D1 组 30.37 ±0.69 28.08 ±0.54＊＊36.62 ±0.71 34.61 ±0.42＊＊模型 D2 组 30.24 ±0.53 28.90 ±0.62＊＊36.64 ±0.45 35.67 ±0.58*

2.3 血液流变学

2.3.1 造模后各组大鼠全血黏度、血浆黏度变化

与正常组比较，各组大鼠全血黏度低切、中切、高切均显著升高，有统计学意义(P＜0.01)，以D1组升高最为明显;血浆黏度升高，除C组无统计学意义外(P ＞0.05)，均有统计学意义(P ＜0.05或 P ＜0.01)。B2组与B1组相比，全血黏度低切、中切、高切均有降低趋势，具有统计学意义(P＜0.05);D2组与D1组相比，全血低切和中切黏度有降低趋势，具有统计学意义(P ＜0.05)(结果见表2)。

各组间相比较，全血黏度、血浆黏度升高趋势为:D1组＞B1组＞D2组＞B2组≥C组。

表2 各组大鼠造模后全血黏度和血浆黏度变化(s，n=10)

表2 各组大鼠造模后全血黏度和血浆黏度变化(s，n=10)

注:与正常组相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

正常A组21.67 ±1.37 4.84 ±0.26 3.60 ±0.12 1.17 ±0.26对照 B1 组 31.27 ±1.92＊＊7.02 ±0.48＊＊ 4.50 ±0.16＊＊ 1.22 ±0.58*对照 B2 组 28.27 ±1.69＊＊6.49 ±0.44＊＊ 4.20 ±0.24＊＊ 1.21 ±0.42对照 C 组 26.82 ±1.16＊＊6.31 ±0.22＊＊ 3.88 ±0.19* 1.20 ±0.32模型 D1 组 33.65 ±2.03＊＊7.15 ±0.37＊＊ 4.62 ±0.21＊＊ 1.26 ±0.24＊＊模型 D2 组 30.48 ±1.97＊＊6.67 ±0.34＊＊ 4.47 ±0.14＊＊ 1.22 ±0.36*

2.3.2 造模后各组大鼠红细胞压积和聚集指数变化

与正常组比较，各组大鼠红细胞压积均显著升高，有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，红细胞聚集指数升高，有统计学意义(P＜0.05或 P＜0.01)。B2组与B1组相比，D2组与D1组相比，红细胞压积、红细胞聚集指数有降低趋势，以D1组升高最为明显(结果见表3)。

各组间相比较，红细胞压积升高趋势为:D1组＞D2组＞B1组＞B2组＞C组;红细胞聚集指数升高趋势为:D1组＞B1组≥C组＞D2组＞B2组。

表3 各组大鼠造模后红细胞压积和聚集指数变化(s，n=10)

表3 各组大鼠造模后红细胞压积和聚集指数变化(s，n=10)

注:与正常组相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

组别 红细胞压积(%)红细胞聚集指数正常A组37.18 ±1.33 6.02 ±0.45对照 B1组 43.08±3.30＊＊ 6.96±0.64*对照 B2组 42.21±2.02＊＊ 6.74±0.55*对照 C 组 41.01 ±2.07* 6.93 ±0.60*模型 D1组 46.22±1.49＊＊ 7.29±0.70＊＊模型 D2组 44.48±1.83＊＊ 6.81±0.50*

3 讨论

中医动物模型是根据中医理论，对人类疾病原型的某些特征进行模拟复制，创造出的具有人工疾病和证的实验动物［2］。近年来，根据中医血瘀证的病因、病机建立的寒凝血瘀证动物模型的方法较多，如吴垦莉等［3］采用对家兔后肢低温冷冻，局部冻伤引起紫绀、水肿造成寒凝血瘀证动物模型;郑小伟等［4］采用全身冷冻法，在大鼠身上复制寒凝血瘀证量化模型;成秀梅等［5］将大鼠置于冰水中造成寒凝血瘀动物模型;王晓岚等［6］采用肾上腺素加冰水浴法造成大鼠寒凝血瘀证急性心肌缺血模型。这些动物模型虽都有其特点，但无论是单因素还是复合因素，在停止作用后其形成的血瘀持续时间均较短暂，与临床血瘀证尚有一定的差距。

毛腾敏等［7］证实未失去平衡的正常机体难以形成“血瘀”，形成后亦能较快恢复;但内伤、外感双重激烈刺激对于未失去平衡的机体亦可形成“血瘀”。中医理论认为:寒为阴邪，主收引，性凝滞，寒邪作用于血脉，血脉收引挛缩，血脉拘挛则其管径变细变窄，血流量减少，另一方面使血液凝滞，血行缓慢而化生瘀血;“气为血之帅，血为气之母”，故气滞可导致血瘀，而血瘀也可引起气滞。七情中的忧怒为血瘀常见病因之一，忧怒两种情志太过，为血瘀证发生的主要原因。依据上述论述，我们以中医理论为指导，结合现代医学病理生理学基础，从“寒凝”与“气滞”两方面入手，建立动物模型。给大鼠皮下注射大剂量肾上腺素注射液模拟“暴怒”时机体分泌大量肾上腺素的特点，以冰水浸泡及持续低温冷冰模拟“寒邪”侵袭，二者综合作用复制出黏、浓、凝状态的“寒凝气滞血瘀证”模型。同时与单纯低温冷冻所致“寒凝血瘀证”和肾上腺素加冰水浴所致“气滞血瘀证”模型进行了对比研究。

实验结果表明，模型组大鼠较正常组有明显的寒凝气滞血瘀症状且体温降低趋势显著;血液流变学显示，模型组大鼠全血黏度、血浆黏度、红细胞压积及红细胞聚集指数升高趋势最为明显。

综上所述，可以认为采用“肾上腺素加冰水浴复合低温冷冻法”方法造成的寒凝气滞血瘀证动物模型，与采用单一的突发强冷刺激造成的“寒凝血瘀证”和药物加冰水浴所致的“气滞血瘀证”相比，更符合血瘀证“久病”、“慢性”的特点，更能接近临床血瘀证的发病过程［8］，符合中医证候特点，也与现代医学的观点相一致。且该模型具有操作方法简单，模型稳定性好等优点，可以确定大鼠寒凝气滞血瘀证模型成立。

［1］韩耀巍，王学岭.寒凝血瘀证实验及临床研究近况［J］.天津中医药大学学报，2009，28(3):167 －168.

［2］谷万里，张俏，史载祥.寒凝血瘀证动物模型的研究述评［J］.中国中医药信息杂志，2007，14(6):89 －91.

［3］吴垦莉，张珊珊.寒凝血瘀证动物模型的研制［J］.中国中医基础医学杂志，1996，2(2):49 －50.

［4］郑小伟.寒凝血瘀证动物模型的量化研究［J］.浙江中医学院学报，1999，23(2):43 －45.

［5］成秀梅，杜惠兰，李丹.寒凝血瘀证动物模型的创建［J］.中国中医基础医学杂志，2005，11(8):604 －605.

［6］王晓岚，张蕴慧.心痛宁对大鼠缺血心肌细胞游离钙浓度的影响［J］.江苏中医药，2002，23(7):44 －45.

［7］毛腾敏，林建和.“血瘀”病例模型探索［J］.北京医科大学学报，1985，17(4):246 －248.

［8］贾丹兵，于淼，李乃民，等.参姜锁阳益气片对寒凝气滞血瘀证大鼠血清中6－keto－PGF1a、TXB2及氧自由基代谢的影响［J］.中医药学报，2014，42(3):26－28.