雷帕霉素洗脱支架系统中雷帕霉素的含量测定

林红赛，黄永富，李 剑，岳卫华

(北京市医疗器械检验所，北京101111)

雷帕霉素洗脱支架系统中雷帕霉素的含量测定

林红赛，黄永富，李 剑，岳卫华

(北京市医疗器械检验所，北京101111)

目的：建立高效液相色谱法测定雷帕霉素洗脱支架中雷帕霉素含量测定的方法并对样品制备方法进行了验证。方法：用waters 1525高效液相色谱仪进行检测，色谱柱为C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇∶乙腈∶水(67∶15∶18)，流速1mL/min，紫外检测器，检测波长为280nm，外标法定量。结果：雷帕霉素的线性范围为19.2～77.6μg/mL(r=0.9993)，检出限为0.388μg/mL，平均加样回收率为98.86%。结论：该方法简便、快速、准确，可用于雷帕霉素洗脱支架系统中雷帕霉素的含量测定。

雷帕霉素洗脱支架；雷帕霉素；高效液相色谱法

0 引言

雷帕霉素又称西罗莫司，是一种大环内酯类抗生素，具有抑制血管平滑肌增殖、抑制血管内膜增生的作用。该药物覆盖于支架表面，可起到防止血管再狭窄的作用。目前雷帕霉素洗脱支架在国内临床上应用已较为普遍，而雷帕霉素洗脱支架产品还没有相应的国家标准或行业标准可做质量评价参考。文献已有反相高效液相色谱法测定组织中或药物中的雷帕霉素的含量，但尚无雷帕霉素洗脱支架产品中雷帕霉素含量测定方法，所以建立一种适用于雷帕霉素洗脱支架中雷帕霉素含量测定的准确方法十分必要。本实验旨在建立评价雷帕霉素洗脱支架中雷帕霉素含量的测定方法并对样品的制备方法的有效性进行了验证。

1 材料和方法

Waters高效液相色谱仪，配紫外检测器(Waters公司)；电子天平(梅特勒-托利多公司)；雷帕霉素标准品(纯度HPLC≥98%，北京北纳创联生物技术研究院)；甲醇(色谱纯，Merck KGaA)；乙腈(色谱纯，Mreda technology Inc)；实验用水为去离子水。

(1)实验条件

色谱柱：C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇∶乙腈∶水= 67∶15∶18；流速：1mL/min；检测波长：280nm。

(2)标准溶液的制备

精密称取对照品9.7mg，加入乙腈溶解并定容至25mL，得到浓度为388μg/mL的对照品储备液。取储备液适量用乙腈逐级稀释，得到浓度为19.2μg/mL、29.1μg/mL、38.8μg/mL、48.5μg/mL、58.2μg/mL和77.6μg/mL一系列标准溶液。

(3)样品的制备

取支架1个，放入5mL棕色瓶中，精密加入5mL乙腈，静置1h，超声10min，用0.45μm滤膜过滤，取滤液作为检验液。

2 结果

2.1 检测波长的选择

将配制好的雷帕霉素标准溶液用紫外分光光度计在190～700nm波长范围内扫描，发现雷帕霉素在280nm处有最大的吸收峰，故选择280nm作为检测波长。波长扫描图见图1。

图1 雷帕霉素标准溶液扫描图

2.2 系统适应性试验

取浓度为38.8μg/mL标准溶液一份，按“(1)”项下的色谱条件进样测定，记录色谱图，结果表明雷帕霉素及其异构体分离良好，雷帕霉素保留时间约为11min，理论塔板数大于3000，拖尾因子1.1；雷帕霉素异构体保留时间约为13.48min，理论塔板数大于5000，拖尾因子1.1，色谱图见图2。

图2 标准溶液和样品溶液色谱图

2.3 线性范围

取标准溶液按“(1)”项下色谱条件进样，记录色谱图，以峰面积(A)对浓度(C)进行线性回归，得回归方程为A=33722.8189C-130752.1；r=0.9993，该结果表明在19.2～77.6μg/mL范围内线性关系良好。以响应值较低的雷帕霉素异构体计算检出限，当稀释对照品溶液浓度至0.388μg/mL时，其信噪比(S/N)等于4.0，故检出限约为0.388μg/mL(S/N=4.0)。

2.4 重复性和稳定性试验

取同一浓度标准溶液5份，按“(1)”项下的色谱条件进样，记录色谱峰面积，RSD为0.91%(n=5)。

室温放置0h、4h和8h后的同一标准溶液，按“(1)”项下的色谱条件连续进样分析，记录峰面积，计算雷帕霉素峰面积的RSD为1.3%。该结果表明雷帕霉素的乙腈溶液制备后室温放置至少8h内稳定。

2.5 加样回收率实验

取已知浓度的样品溶液9份，分别加入低、中、高三种浓度的标准溶液，每个浓度平行测试3份，按“(1)”项下的色谱条件进样，记录色谱峰面积，低、中、高浓度的平均回收率分别为98.66%、99.18和98.73，总平均回收率为98.86%。

Table 1 Results of recovery test

2.7 样品制备方法的确定和测定结果

1)取按“(3)”项下洗脱后的支架，置于新的容器中，加入2.5mL乙腈溶剂，并确保支架完全浸没于溶剂中，超声30min，用0.45μm滤膜过滤，取滤液进样测定，结果未发现雷帕霉素色谱峰。

2)取样品，按“(3)”项下制备样品，按“(1)”项下的色谱条件测定，按外标法计算检验液中雷帕霉素的含量，结果测得单个支架中雷帕霉素含量为141.04μg。

4 小结

(1)雷帕霉素在溶液中存在互变异构现象，异构体色谱峰与雷帕霉素色谱峰的相对保留时间约为1.2min，在计算雷帕霉素含量时可将色谱图中的雷帕霉素峰和雷帕霉素异构体峰合并计算。

(2)单个雷帕霉素洗脱支架在5mL乙腈中静置1h后，发现少量白色的涂层材料已被洗脱下来，故测定前需要过滤。洗脱后的支架再次超声洗脱未发现雷帕霉素色谱峰，表明静置1h后超声10min的处理方法已能使支架中的雷帕霉素完全洗脱下来。

(3)本文建立了雷帕霉素洗脱支架高效液相色谱检测方法，并对方法的有效性和样品的制备方法进行了评价，结果显示本方法具有灵敏、快速、方便之特性，可以满足雷帕霉素洗脱支架含量测定的要求。

[1]陈宏林，尤庆生，孟小勇.HPLC法测定组织中雷帕霉素的含量[J].实用医药杂志，2008，25 (7) ：813-814.

[2] 任斌，黎曙霞，邓斌等.高效液相色谱法测定西罗莫司血药浓度[J] .中国药学杂志，2004，39 (1) ：52-53.

[3] 魏静，徐国旭，龚铠等.雷帕霉素眼膏的制备及其含量测定[J].中国现代医药杂志，2010，12 (6) ：11-14.

[4] Philip Hughes，John Musser，Mary Conklin. The isolation，synthesis and characterization of an isomeric form of rapamycin[J]. Tetrahedron Letters，1992，33 (33) ：4739.

Determination of rapamycin in rapamycin -eluting stent by HPLC

LIN Hong-sai, HUANG Yong-fu, LI Jian, YUE Wei-hua

(No.7, Xingguang 2nd Street, Opto-Mechatronics Industial Park, Tongzhou District, Beijing, China, 101111)

Objective:To establish a method for determination of rapamycin in rapamycin-eluting stent by HPLC with ultraviolet detection and verify the efficiency of sample preparation. Method: HPLC analysis of rapamycin was performed by a Waters 1525 chromatography equipped with a C18 (250mm×4.6mm, 5μm) column and quantified by external standard method. The mobile phase was a mixture of methanol, acetonitrile and water (67∶15∶18) and the flow rate was 1mL/min. The detection wavelength was at 280nm.Result: The linear range of rapamycin was 19.2μg/mL～77.6μg/mL(r=0.9993).The limt detection was 0.388μg/mL and the average recovery was 98.86%. Conclusion: The method is simple, rapid and accurate for the content determination of rapamycin in rapamycin -eluting stent.

rapamycin ; rapamycin -eluting stent;HPLC

2014-01-15

R972

A

1002-2376(2014)08-0007-03