神经电刺激对骨折愈合过程中CGRP表达影响的实验研究

田振峰，郭 洁，武建忠，高雁冰，徐建杰，喻伟光

(1. 河北省石家庄市第一医院，河北 石家庄 050011；2. 河北省中医院，河北 石家庄 050011)

神经电刺激对骨折愈合过程中CGRP表达影响的实验研究

田振峰1，郭 洁2，武建忠1，高雁冰1，徐建杰1，喻伟光1

(1. 河北省石家庄市第一医院，河北 石家庄 050011；2. 河北省中医院，河北 石家庄 050011)

目的 通过观察降钙素基因相关肽(CGRP)在骨折部位表达的时空变化，探讨电刺激对骨折愈合的影响及调控机制。方法 选用健康新西兰雄兔40只，取双侧桡骨建立分离骨折模型，以左侧桡骨为实验组进行神经电刺激，右侧为对照组给予假刺激。分别在术后第1，7，14，21，28天取标本，应用免疫组化及HE染色测定CGRP在新生骨痂中的表达变化。结果 免疫组化染色检测发现相同时期神经电刺激组CGRP表达量的平均光度值明显高于对照组，实验组CGRP的峰值持续时间长，CGRP分布范围广，2组比较有显著性差异(P均<0.05)。结论 电刺激能够使周围神经组织CGRP分泌量增加，周围神经系统通过CGRP等神经肽物质在早期骨修复及后期骨痂塑形改建过程中发挥重要调节作用，其表达量与骨折愈合呈正相关；通过神经电刺激等措施能够促进神经支配区域的骨折愈合。

骨折；CGRP；神经电刺激

近年来临床及实验研究发现骨折不愈合及延迟愈合较常见，并受诸多因素的影响和调控，其中神经系统的调节作用占有非常重要的地位。电针及电刺激治疗骨折的研究已有数十年，很多学者在实验和临床研究方面进行了很多有益的探索，并取得了一定进展，但其作用机制有待深入探讨。本研究通过动物实验，以神经电刺激为干预因素，观察骨折局部降钙素基因相关肽(CGRP)的时空分布变化，证明通过刺激周围神经达到促进骨折及骨缺损修复的可行性，为临床治疗提供理论依据。

1 实验资料

1.1 实验动物与分组 选用健康雄性新西兰兔40只，体质量2.5～3.0 kg(河北医科大学实验动物中心提供)，所有实验动物取双侧桡骨建立分离骨折模型，以左侧桡骨为实验组进行神经电刺激，右侧为对照组假刺激。

1.2 模型的建立 术区备皮，经耳缘静脉注入2.5%戊巴比妥钠(1 mL/kg)。无菌条件下手术造成双侧桡骨中段2 mm横断骨折，骨折断端不予固定，止血缝合伤口。术后所有实验动物相同条件下喂养，动物饲养选用标准饲料喂养。

1.3 实验组神经电刺激治疗 应用EM2000型神经电刺激仪, 术后立即对实验动物左侧肢体给予神经电刺激，1次/d,20 min/次。主要参数: 脉冲频率1～80 Hz,脉冲宽度300 ms,输出电压为0～49 V,输出电流0～98 mA,波形为对称双相方波。治疗时将刺激电极正极置于实验动物左前肢臂丛神经近端, 负极置于骨折部位远端。刺激持续时间0.8～1.0 ms，频率为5～10 Hz,刺激强度为10～40 mA,治疗时调整强度,可看到被刺激肢体肌肉发生收缩。

1.4 骨痂标本采集及制作 于实验模型建立后第1，7，14，21，28天,分别随机选择8只动物处死,截取桡骨骨折部骨痂及软组织。生理盐水冲洗后立即置入4%多聚甲醛(pH=7.4)中,4 ℃下固定24～48 h,经20% DETA2Na脱钙4周,3 d更换脱钙液1次,脱钙满意后,梯度乙醇脱水,二甲苯透明，纵向石蜡包埋。将蜡块置入4 ℃冰箱备用。

1.5 CGRP组织学及免疫组织学染色 自冰箱取出组织蜡块,做5 μm纵向切片,先行HE染色,后行SABC法观测骨痂组织中神经肽CGRP在各时间段上和相关组织细胞中的表达。阴性对照:以相邻切片进行同步操作,不加第一抗体。阳性判断:以标本中细胞胞浆出现棕黄色颗粒作为阳性细胞。根据染色强度分为弱阳性(淡黄色)、中等阳性(棕色)、强阳性(棕褐色)。采用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统对免疫组化结果进行定量分析，以平均积分吸光度作为CGRP表达程度, 对各项检测指标在相关细胞中表达程度进行定量检测。平均光度值越高, 表示表达越强。

1.6 统计学处理 数据用SPSS软件处理。计量资料比较采用t检验，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 组织学观察结果 实验组早期纤维骨痂中新生骨小梁较多，呈条索状，外周可见成骨细胞增殖活跃。术后第14天骨小梁变粗大致密，排列成栅栏状，第21天时骨小梁已相互连接成片。对照组早期纤维骨痂中骨小梁明显较治疗组少，成骨细胞偏少，中后期骨小梁生长速度较慢，致密程度低于同期实验组。神经电刺激组骨折周围血管增生活跃，后期骨痂生长及骨痂成熟度均优于对照组。

2.2 CGRP表达 实验组及对照组术后第1天CGRP在细胞中着色程度无显著性差异(P>0.05)。术后第7天时2组CGRP表达均达高峰, 实验组软骨细胞、成纤维细胞染色呈阳性,多沿血管呈灶性分布，染色呈棕褐色；但对照组染色呈棕黄色，呈弱阳性，散在点状分布。实验组吸光度值高于对照组(P<0.01)。术后第14天实验组CGRP表达程度较前略有降低，仍呈棕褐色，分布范围广；而对照组CGRP染色水平较前降低明显，2组比较有显著性差异(P<0.01)。术后第21天2组CGRP表达量均较前明显减少，实验组编织骨边缘仍有较多CGRP免疫阳性神经纤维分布；对照组着色细胞逐渐减少,表达程度降低。实验组CGRP高浓度持续时间较对照组长(P<0.01)。 随着骨折逐渐愈合，术后第28天2组CGRP表达恢复至骨折前水平,但实验组CGRP表达的平均光度仍高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 2组不同时点CGRP表达情况(吸光度)比较

3 讨 论

周围神经组织通过多种途径对骨折愈合发挥调控作用，其中通过感觉神经分泌神经肽对骨折愈合发挥作用非常重要。CGRP是重要的神经肽之一，通常以分泌颗粒的形式储存在感觉神经末梢，分布于骨骼等靶器官发挥生物学效应。Hukkanen等[1]切断大鼠的坐骨神经后发现神经损伤组的骨痂量较单纯骨折组多，生物力学强度差。Onuoha[2]对各种骨折患者24 h内血液循环中SP和CGRP水平进行检测，发现其较正常对照组明显增高，提示一个完整神经系统对于炎症和创伤修复的启动具有十分重要的作用。四肢长骨是骨折损伤的好发部位，生长发育代谢活跃，神经组织分布极其丰富，是观察神经对骨折影响的理想部位。

近年来研究表明,CGRP通过成骨细胞、破骨细胞上的CGRP受体参与调节骨生长剂塑型；同时神经肽从神经末梢释放,在骨内局部形成高浓度,诱导骨形成[3]。影响骨折愈合最根本的因素是局部血液供应,而CGRP是迄今为止发现的最强内源性扩血管肽,具有很强的血管调节活性[4]，同时有刺激血管内皮细胞增殖、促进血管生成作用。Hukkanen等[1]给游离猪小梁骨灌注CGRP实验发现，机械剥离血管内皮后CGRP的扩血管作用依然很强，可见CGRP扩血管作用主要通过作用于血管平滑肌来实现。

本实验研究通过对实验组和对照组的5个时段骨痂中CGRP免疫组织化学染色，测定其平均光密度值并进行分析发现2组骨折断端CGRP水平均较损伤前高，且随着骨折愈合过程而增减，这证明了周围神经组织通过神经肽物质对骨折愈合发挥重要的调控作用，骨折愈合与CGRP的平均光度值呈正相关。实验结果显示术后第1天实验组及对照组CGRP分布无明显差别。实验组术后CGRP在骨折局部的分泌量增加迅速，术后第7—14天为高峰期，其后缓慢减少，对照组骨折部位骨痂内神经肽CGRP分泌量同样在术后逐渐增加，术后第7天逐渐达高峰，术后第14天逐渐表达减弱，在相同时间段比较可见实验组在CGRP表达增长速度、高峰水平及高峰持续时间方面均显著高于对照组。术后第21天及第28天实验结果显示随着骨折愈合逐渐完成，实验组及对照组骨痂部位CGRP均较前明显减少，但实验组仍保持较高浓度，2组比较有显著性差异。故笔者认为神经电刺激能够有效增强感觉神经末梢CGRP等神经肽的分泌量，从而使骨折局部CGRP等神经肽物质呈高水平分布，进而促进骨折修复愈合，增强骨痂强度，缩短骨折愈合时间，这为临床应用电刺激治疗骨折及骨折不愈合等复杂损伤提供了理论基础。

[1] Hukkanen M,Konttinen YT,Santavirta S,et al. Effect of sciatic nerve section on neural ingrowth into the rat tibial fracture callus[J]. Clin Orthop,1995(311):247-257

[2] Onuoha GN. Circulating sensory peptide levelswithin 24 h of human bone fracture[J]. Peptides,2001,22(7):1107-1110

[3] Schaffer M. Neuropeptides Pmediator of inflammationand tissuerepair[J]. Arch Sury,1998,133(12):1107

[4] 王体沛,张家军. 肱骨下端骨折术后骨不愈合的治疗[J]. 华中医学杂志,2002,26(4):181

Experimental study of the effect of electrical nerve stimulation on the expression of CGRP in healing of bone fracture

Tian Zhenfeng1，Guo Jie2，Wu Jianzhong1，Gao Yanbing1，Xu Jianjie1，Yu Weiguang1

(1. The First Hospital of Shijiazhuang City, Shijiazhuang 050011, Hebei, China；2. Hebei Hospital of TCM,Shijiazhuang 050011,Hebei,China)

Objective It is to explore the effect of electrical stimulation on healing of bone fracture and its adjustment-control mechanism by observing the space-time changes of expression of calcitonin gene-related peptide(CGRP) in fracture position. Methods Forty healthy male New Zealand rabbits were chosen to establish separated fracture models using their radius of both sides. The radius of the left side was as experimental group which was given nerve electrical stimulation, and the radius of the right side was as control group which was given sham stimulation. The samples were collected respectively in 1, 7, 14, 21, 28 days after operation to detect the expression of CGRP in new grown osteotylus by immunohistochemical and HE staining. Results Immunohistochemical staining detection showed that the average photometric value of the expression of CGRP in electrical stimulation group was significantly higher than that of control group at the same stage. The lasted time of peak value of CGRP was longer and distribution range was wider than that of control group, there were significant differences between both groups(P<0.05). Conclusion Electrical stimulation can increase the production of CGRP by peripheral nerve tissue. Peripheral nerve system plays an important adjustment effect in early bone repair and late bone callus formation and reconstruction by neuropeptide such as CGRP whose secretion was positively related with bone fracture. It indicates that bone fracture healing can be promoted by electrical stimulation on the nerves which control this fracture part.

bone fracture; CGRP; nerve electrical stimulation

田振峰(1980—)，男，主治医师，硕士，主要从事手外科神经功能重建及骨折治疗。

石家庄市科技指导计划课题(12146903)

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.02.005

R-332

A

1008-8849(2014)02-0125-03

2013-07-15