水稻幼苗叶片应答稻瘟病侵染的差异蛋白谱分析

唐 成, 陈 露, 安敏敏, 孟 丹, 杨立明, 罗玉明

(1.淮安市高新技术创新中心, 江苏 淮安 223301;2.淮阴师范学院 生命科学学院 江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室, 江苏 淮安 223300;3.南京师范大学 生命科学学院, 江苏 南京 210046)

水稻幼苗叶片应答稻瘟病侵染的差异蛋白谱分析

唐 成1, 陈 露2,3, 安敏敏2, 孟 丹2, 杨立明2, 罗玉明2

(1.淮安市高新技术创新中心, 江苏 淮安 223301;2.淮阴师范学院 生命科学学院 江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室, 江苏 淮安 223300;3.南京师范大学 生命科学学院, 江苏 南京 210046)

为了探讨水稻感病基因型种质响应稻瘟病侵染的蛋白质表达谱的变化规律和作用途径,以水稻感稻瘟病种质日本晴为材料,采用接种稻瘟病菌分生抱子悬浮液,24,48和72 h后提取叶片蛋白质,采用iTRAQ蛋白质组学技术研究稻瘟病胁迫下水稻叶片蛋白质组的变化．结果表明,稻瘟病侵染诱导了水稻幼苗叶片内涉及氧化还原平衡、防御、信号传导、糖和能量代谢、氨基酸代谢、光合作用,以及蛋白质代谢等代谢途径相关的53个蛋白质的表达量发生了改变．GO分析表明稻瘟病主要调控了植株体内细胞内平衡、代谢过程和蛋白质代谢等生物学过程．稻瘟病侵染激活了活性氧代谢、防御,以及热休克蛋白等相关的途径,而抑制了蛋白质生物合成过程．结合这些差异表达蛋白的丰度变化结合它们可能的功能,描绘了水稻应答稻瘟病侵染的蛋白质代谢网络,有助于在蛋白质水平上了解其应答过程．

水稻稻瘟病; 差异表达蛋白质; 代谢途径; iTRAQ技术

0 引言

关于水稻抗稻瘟病相关的蛋白质组学研究报道目前尚不多见．Kim 等人[1]以萌发的稻瘟病菌分生孢子及附着胞正在形成时的分生孢子为实验材料进行的,结果鉴定了5个新的稻瘟病菌差异表达蛋白,并且进一步研究了差异表达蛋白在附着胞形成过程中的作用．谢娟等[2]发现稻瘟病菌侵染后抗性品种出现了一个表达量非常大的新蛋白．通过分析感抗品种对稻瘟病菌不同的生理学反应可以推测,这个新蛋白与其他表达量增加的蛋白点一样与水稻受稻瘟病菌侵染后引起的应答反应相关,是稻瘟病菌侵染后由无毒基因诱导产生的新的功能性蛋白．朱永生等[3]研究了水稻叶鞘接种亲和与非亲和稻瘟病菌株不同时间的蛋白质表达差异,结果表明,接种亲和与非亲和菌株后,水稻叶片具有相似的也有不同的蛋白质表达差异．并且这些差异无论是在各个处理时间之间内还是在各个处理之间都存在一定的规律性．纵向的比较分析表明,由非亲和反应诱导产生的抗性蛋白质在数量与表达量上均要高于由亲和反应诱导产生的蛋白质．上述以双向电泳结合质谱技术的蛋白组学研究有助于在蛋白质水平上了解水稻水稻稻瘟病抗性的分子机制．目前,基于液相色谱-质谱技术的蛋白质组学技术的快速发展和应用为开展植物重要性状的分子机制的研究提供了一种新的平台．该技术在蛋白质分离的数目和定量的准确性等方面具有更大的优势[4]．

本文利用基于同位素相对标记与绝对定量技术(iTRAQ)的蛋白质组学方法分析了水稻感病种质日本晴幼苗叶片在受稻瘟病菌侵染后的差异蛋白质表达谱的变化,发掘出稻瘟病诱导的蛋白质变化规律,同时通过生物信息学技术分析了上述差异表达蛋白的生物学过程、分子功能和细胞定位,并对上述稻瘟病应答蛋白参与的分子网络进行了发掘．

1 材料与方法

1.1 水稻幼苗培养和稻瘟病菌侵染

实验选用的水稻材料为感病种质日本晴,在智能人工气候箱中用1/2 Hoagland营养液培养,昼/夜温度分别为28℃和26℃,相对湿度为 70%～80%．当幼苗长至1叶1心时,进行喷雾接种处理．所接种的稻瘟病病菌菌株为淮安本地的稻瘟病菌混合生理小种．对照材料是在水稻幼苗的叶片上均匀喷雾接种缓冲液,接菌处理株则是在叶片上喷雾接种．在接种后的第24,48和72 h取样．每个样品设置3个重复．

1.2 蛋白质的提取

水稻幼苗叶片在液氮中研磨,按照1:10(W/V)加入裂解液(7 mol/L尿素,2 mol/L硫脲,4%CHAPS),涡旋混匀．室温下超声60 s,浸提30 min．然后在10℃下，14 000 rpm,离心1 h,小心取出上清液,并用Bio-Rad 蛋白定量试剂盒进行定量．上清液分装后冻存于-80℃．

1.3 蛋白质酶解和iTRAQ标记

取200 μg蛋白溶液置于离心管中,加入4 μL还原试剂,60℃反应1 h,加入2 μL半胱氨酸-阻断剂,室温10 min．将还原烷基化后的蛋白溶液加入超滤管中,12 000 rpm离心20 min,弃掉收集管底部溶液．加入iTRAQ试剂盒中的溶解液100 μL,12 000 rpm离心20 min,弃掉收集管底部溶液,重复3次,更换新的收集管,在超滤管中加入胰蛋白酶,总量4 μg(与蛋白质量比1:50),体积50 μL,37℃反应过夜．12 000 rpm离心20 min,酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部．再加入50 μL溶解液,12 000 rpm离心20 min,与上步合并,收集酶解后的样品．

从冰箱中取出iTRAQ试剂,平衡到室温,将iTRAQ试剂离心至管底．向每管iTRAQ试剂中加入150 μL异丙醇,涡旋振荡,离心至管底．取50 μL样品,将iTRAQ试剂填加到样品中,涡旋振荡,离心至管底,室温反应2 h．然后加入100 μL水终止反应．其中对照样品、24，48和72 h的样品分别用113、114、115和116进行标记．

1.4 酶解肽段的分离、LC-MS/MS质谱分析和蛋白质鉴定

酶解肽段的分离、LC-MS/MS质谱分析和蛋白质鉴定参考zhu等[5]人的方法,并作简要修改,混合标记后的样品用50 μL流动相A(98%H2O,2%乙腈,pH 10)溶解,14 000 rpm离心20 min,取上清液待用．取50 μL准备好的样本进样．用流动相B(98%乙腈,2% H2O,pH 10),洗脱,流速为0.7 mL/min．根据紫外监测情况,将RP分离得到的组份合并为10个,合并时采用30 μL 2% ACN,0.1% FA,加入第一个离心管,涡旋振荡并离心后,转入第二个离心管,依次直至合并组份最后一管．上述分级后的多肽样品经12 000 rpm离心10 min,吸取上清液进行LC分离和MS/MS(AB Sciex TripleTOFTM5600)分析．质谱数据用ProteinPilot 4.0软件检索本地化的水稻蛋白质数据库．

1.5 差异表达蛋白的生物信息学分析

使用Pfam数据库[6]和InterPro数据库[7]进行差异蛋白的功能分类．对于注释为未知或假定的蛋白的身份,在NCBI蛋白质数据库中进行同源蛋白检索．使用iProClass Gene Ontology进行差异表达蛋白质所参与的生物学过程、涉及的分子功能和细胞内定位的分析．

2 结果与分析

2.1 稻瘟病侵染后水稻幼苗叶片表型和稻瘟病浸染应答蛋白质表达谱的变化

在形态性状方面,稻瘟病菌浸染后15天后水稻幼苗叶片出现了明显的变化,叶片上出现了明显的病斑,日本晴幼苗叶片表现出感病的表型．这与Ribot等[8]和Carrillo等[9]的报道类似,表明水稻材料日本晴是稻瘟病感病种质．

用iTRAQ方法检测稻瘟病侵染水稻幼苗叶片引起的差异表达的蛋白质,通过比较稻瘟病侵染后的幼苗叶片与对照材料的蛋白质表达量的相对变化,检测到53个蛋白质在稻瘟病菌侵染前后表现出2倍以上的变化(p<0.05)(表1)．稻瘟病侵染引起了水稻幼苗叶片蛋白质表达丰度的上调或下调,根据差异表达蛋白的丰度变化趋势,差异蛋白的变化谱大致可以分为三类,类I为受稻瘟病菌侵染蛋白质表达丰度上调的类群,类II为受稻瘟病菌侵染蛋白质表达丰度上调后再下调的类群,类III为受稻瘟病菌侵染蛋白质表达丰度下调的类群(图1)．这种趋势与在转录水平上检测到的情况有部分类似[10]．

表1 水稻应答稻瘟病侵染的差异表达蛋白质

图1 稻瘟病菌侵染水稻叶片后差异表达蛋白质的聚类分析

2.2 差异表达蛋白的鉴定和功能分类

响应稻瘟病侵染的53个差异表达的蛋白质在植物蛋白质数据库中进行同源比对,50个蛋白质具有明确的功能,3个蛋白质被注释为未知的蛋白(表1)．基于水稻幼苗叶片的代谢与功能特征,这些蛋白质分为主要的9个类群,包括防御/抗性蛋白、氧化还原、信号转导、光合作用、糖代谢、能量代谢、蛋白质合成、蛋白质折叠与组装、氨基酸代谢,以及未知蛋白(图2)．其中所占比重最大的三个功能类群是防御/抗性蛋白、氧化还原和信号转导,说明稻瘟病侵染引起了水稻幼苗叶片的自身防御系统的响应,以及对侵害的一种反应．

图2 稻瘟病菌侵染水稻叶片后差异表达蛋白质的功能分类

2.3 差异表达蛋白的GO分析

为了进一步了解稻瘟病诱导的差异表达蛋白质的功能,对差异表达的蛋白质进行了生物学过程、分子功能和细胞内定位的分析．稻瘟病调控的差异蛋白质主要涉及到细胞内平衡、代谢过程、胁迫应答和蛋白质修饰等生物学过程,同时也调控了光合作用、次生代谢、细胞生长和翻译等过程(图3A)．至于差异蛋白质的分子功能分类方面,结合活性(包括RNA结合活性、蛋白质结合活性和碳水化合物结合活性等)是最主要的一族,同时也涉及到水解酶活性、激酶活性、调控因子活性和结构分子活性等(图3B)．另外,这些差异表达蛋白质的细胞定位主要在细胞核、细胞质、质体和线粒体等部位(图3C)．上述结果表明稻瘟病侵染诱导了水稻幼苗叶片内多个生物学过程,涉及到多样化的分子功能和细胞内区域．这种情况与Bagnaresi等人[10]在转录水平上获得稻瘟病诱导的早期应答的差异表达基因结果类似．

图3 稻瘟病菌侵染水稻叶片后差异表达蛋白质的GO分析

2.4 差异表达蛋白涉及到叶片的抗氧化系统的应答

响应稻瘟病菌侵染的差异表达的蛋白质中有26个蛋白质是与叶片抗氧化反应相关,这些蛋白质可以分成4类,包括胁迫防御、氧化还原平衡,信号传导和氨基酸代谢(表1)[11]．在7个胁迫防御类的差异蛋白中,5个蛋白质(胰蛋白酶抑制剂,DREPP2蛋白,病程相关蛋白Bet v I,profilin A 蛋白,类索马甜蛋白)在稻瘟病菌侵染的叶片中的丰度增加,2个蛋白质(半胱氨酸蛋白酶抑制剂,TPR结构域蛋白)的丰度降低(表1)．其中,病程相关蛋白Bet v I和类索马甜蛋白是植物体内的主要病程相关蛋白,受病原菌侵染后增强表达[12,13]．植物受到生物胁迫后,组织细胞内的活性氧代谢和氧化还原平衡会受到影响,并进而通过该途径传递胁迫的信号[14]．涉及氧化还原平衡的6个差异表达的蛋白质,包括氧爆发增强子蛋白,核氧化还原蛋白1-1,过氧化物酶,硫氧还蛋白M,过氧化氢酶前体等,在稻瘟病菌侵染后表达量都增加,表明水稻叶片感稻瘟病后,叶片内的活性氧代谢被激活,并使活性氧的含量增加,进而加重了对叶片的伤害．

植物受到病原菌侵染后,会激发细胞内的信号途径以传导胁迫的作用．特别是受体类激酶,往往是是植物感受病原菌侵染,传递胁迫信号的主要途径．在稻瘟病菌侵染后检测到SRP受体类蛋白,果糖激酶,磷酸核酮糖激酶表达丰度降低,而磷酸果糖激酶β亚基,类受体蛋白激酶,2-丁酮激酶受稻瘟病诱导丰度增加．由此表明,水稻感染稻瘟病后启动了不同的信号途径以传导机体的免疫应答．另外,与氨基酸代谢相关的蛋白质在稻瘟病菌侵染后表现出表达丰度的变化,包括类抗真菌蛋白、天冬氨酸合成酶、色氨酸合成酶1、S-腺苷甲硫氨酸合成酶2、苯丙氨酸解氨酶．上述这些结果显示差异表达蛋白质的丰度变化与总体的抗氧化防御应答之间的关系在水稻叶片抗稻瘟病中发挥着重要作用．

2.5 差异表达蛋白涉及到光合过程、能量代谢和蛋白质代谢

稻瘟病菌侵染诱导了与光合作用相关蛋白质的表达变化．光系统I反应中心亚基II、原叶绿素酸脂还原酶B在稻瘟病菌侵染后丰度降低,暗示着叶绿体结构受到伤害;而转位酶SECY亚基、细胞色素b5还原酶的丰度增加,说明机体在光合过程受到抑制时,为了满足体内对能量的需求,光电子传递过程的应激性反应的提高．另外,稻瘟病菌侵染过程中,涉及到糖代谢和能量代谢的蛋白质的丰度明显增强(表1),表明机体需要消耗更多能量以应对稻瘟病的伤害．

另外,稻瘟病菌侵染也诱导了与蛋白质生物合成、蛋白质折叠和修饰等过程的改变．其中涉及到与蛋白质生物合成相关的蛋白质的表达谱在稻瘟病菌侵染后丰度降低,表明水稻叶片感稻瘟病后抑制了蛋白质的合成．而涉及到蛋白质折叠和修饰类的蛋白质群的丰度却明显增强,暗示着稻瘟病诱导了水稻叶片内更多的蛋白质变化,需要折叠和修饰类的蛋白质进行调控,进而增强了这类蛋白的表达．

3 结论

稻瘟病菌侵染感病基因型的水稻种质后,诱导了水稻叶片内强烈的应激反应,特别是涉及到氧化还原平衡的蛋白质群的表达谱变化和抗氧化防御类的蛋白质的增强表达．同时,稻瘟病菌侵染也诱导了光合过程的蛋白质的丰度改变,以及代谢类蛋白质变化．这些结果描述了水稻叶片对稻瘟病的应答策略,以及叶片内发生的一系列事件．

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[责任编辑：蒋海龙]

Proteomic Analysis Reveals an Intimate Protein Pathways
Provoked by Blast in Rice Seedling Leaves

TANG Cheng1, CHEN Lu2,3, AN Min-min2, MENG Dan2, YANG Li-ming2, LUO Yu-ming2

(1.Hi-tech Innovation Center in Huaian City, Huaian Jiangsu 223301, China)(2.Jiangsu Key Laboratory for Eco-Agricultural and Biotechnology Around Hongze Lake/School of Life Sciences, Huaiyin Normal University, Huaian Jiangsu 223300, China)(3.School of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing Jiangsu 210046, China)

To investigate the responses of rice seedlings to blast infection, changes in protein expression were analyzed using a comparative proteomics approach. After infection of blast for 24h, 48h and 72h on two weeks old rice seedlings, 53 differentially expressed proteins were detected. These identified proteins are involved in different biochemical responses and metabolic processes with obvious functional tendencies toward redox homeostasis, defense, signal transduction, protein metabolism, photosynthesis, carbohydrate/energy metabolism, and amino acid metabolism. Gene Ontology analysis reveals primary metabolism, redox homeostasis and protein metabolism are the most highly affected biological processes by rice blast infection. The abundance changes of these proteins, together with their putative functions produce an protein pathways in response to blast infection at the protein level in rice seedling leaves. Such a protein network may contribute to further understand the possible strategy of cellular activities occurring in rice seedling leaves responding to blast infectioin.

rice blast; differentially expressed proteins; metabolic pathways; iTRAQ

2014-06-06

江苏省农业科技自主创新基金项目(CX[12]3048); 淮安市农业科技支撑计划项目(SN130127); 江苏省高校优秀科技创新团队资助项目

唐成(1982-),男,江苏沭阳人,农艺师,硕士,研究方向为水稻品质与分子机理研究. E-mail: yumingluo@163.com

S184; S511

A

1671-6876(2014)04-0322-07