巴马司他对高血压小鼠模型血压及血清基质金属 蛋白酶9水平的影响

李慧，彭利静，刘薇，叶明霞，拓步雄

论著·基础

巴马司他对高血压小鼠模型血压及血清基质金属 蛋白酶9水平的影响

李慧，彭利静，刘薇，叶明霞，拓步雄

目的探讨外源性基质金属蛋白酶9(MMP-9)抑制剂巴马司他对高血压小鼠血压及其血清中MMP-9水平和活性的影响。方法将36只高血压小鼠(高血压组)平均分为3个亚组，每组12只，连续3 d分别以巴马司他30 mg/kg(高剂量亚组)、10 mg/kg(低剂量亚组)和生理盐水(对照亚组)对小鼠腹腔进行注射，依次在最后1次注射后0 h、2 h、4 h、6 h对各组小鼠血清中MMP-9及其mRNA水平进行检测；应用明胶酶谱法检测各组小鼠血清中MMP-9活性。选择健康小鼠36只为健康对照组，检测血清MMP-9、mRNA水平，并与高血压组比较。结果(1)血压变化：与健康对照组比较，高血压组用药前血压较高，差异有统计学意义(P<0.05)，用药后，与对照亚组及低剂量亚组比较，高剂量亚组血压降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)血清MMP-9浓度：与健康对照组比较，用药前高血压组MMP-9蛋白浓度显著高 (P<0.01)，用药后，组内比较：高剂量亚组和低剂量亚组小鼠血清中MMP-9蛋白表达水平均随着药物作用时间的延长而降低，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；与低剂量亚组、对照亚组比较，高剂量亚组在2 h、4 h、6 h血清MMP-9浓度均较低，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；低剂量亚组与对照亚组比较，2 h、4 h、6 h差异亦均有统计学意义(P<0.05)。(3)MMP-9 mRNA表达：与健康对照组比较，高血压组MMP-9 mRNA水平显著升高 (P<0.05)；用药后，高剂量亚组和低剂量亚组小鼠血清中MMP-9 mRNA水平均随着药物作用时间的增加而降低，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；对照亚组、低剂量亚组、高剂量亚组两两比较差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。(4)MMP-9活性测定：随着巴马司他给药剂量的增加，Pro-MMP-9和Active-MMP-9活性呈减弱趋势。结论巴马司他能够降低高血压小鼠血压水平及其血清中MMP-9水平和活性。

巴马司他；基质金属蛋白酶9；高血压；小鼠

近年来，随着人们生活习惯的改变，肥胖人群的数量日益增多，同时也使得高血压的患病率呈逐年上升趋势[1]。高血压是一种常见的慢性非传染性疾病，心肌梗死、脑卒中、慢性肾脏病及心力衰竭是其主要并发症，其中原发性高血压还被认为是一种多因素疾病，尽管一些新的治疗策略能有效地降低血压，但由高血压诱导的肾衰竭或损伤的发病率和病死率并没有降低[2,3]。此外，高血压的发病人群趋于年轻化，中青年患病率逐年上升。研究表明，细胞外基质在维持组织的完整性方面具有关键作用，其中基质金属蛋白酶/组织金属蛋白酶抑制剂系统(matrix metalloproteinases/tissue inhibitors of metalloproteinases，MMPs/TIMPs)参与并调节细胞外基质的代谢[4]。近年来随着对MMPs/TIMP研究的日益深入，其在高血压方面的作用也越来越受到关注。Huang等[5]研究发现基质金属蛋白酶3(matrix metallopeptidase-3, MMP-3)和基质金属蛋白酶-9(matrix metallopeptidase-9, MMP-9)基因变异能够通过影响动脉硬化程度和血管内皮功能来促进单纯收缩期高血压的进展。此外，MMP-9可能在高血压血管重构的早期阶段起着关键作用[6]。同时，研究发现外源性MMP-9抑制剂巴马司他(BB-94)可以减少MMP-9介导的血管功能障碍[7]。因此，本研究着重探讨了巴马司他对高血压小鼠及其血清中MMP-9水平和活性的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 高血压小鼠和健康小鼠各36只，分别为高血压组、健康对照组，均为BALB/c品系，清洁级，6～8周龄，平均体质量为(24.1±1.3)g，均购自第二军医大学附属瑞金医院高血压研究所。主要试剂与仪器：巴马司他(batimastat)购自武汉金诺化工有限公司；MMP-9酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购自美国R&D公司；明胶酶谱试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司；TRIZOL试剂购自Invitrogen公司；Realtime PCR Master Mix(SYBR Green)购自Applied Biosystems公司；Bio-TekELX-800酶标仪购自美国BIO-TEK公司；Softron BP-98A智能无创血压计购自北京软隆科技有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 血压测定： 实验前，所有小鼠在良好舒适的环境中饲养1周。采用以尾压法[8](Tail-cuff法)为测量方式的Softron BP-98A智能无创血压计(测压范围350 mm Hg以下)对实验小鼠血压水平进行测定。

1.2.2 药物干预： 将36只高血压小鼠随机分为3个亚组(每组12只)：高剂量亚组、低剂量亚组及对照亚组，连续3 d分别于小鼠腹腔注射巴马司他：30 mg/kg、10 mg/kg、0 mg/kg(生理盐水0.2 ml)[9]。

1.3 观测项目

1.3.1 MMP-9浓度： 最后1次注射给药后，分别于0 h、2 h、4 h、6 h采集小鼠尾静脉血200 μl，采用ELISA试剂盒测定，根据试剂盒使用说明书进行操作，用Bio-TekELX-800酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值(A)，计算样品浓度。

1.3.2 MMP-9 mRNA表达： 按照说明书提取血白细胞中的总RNA。采用Realtime PCR Master Mix试剂盒进行RT-PCR实验。MMP-9以及内参β-actin引物序列通过Genefisher软件设计，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。小鼠MMP-9基因上游引物序列为：5’-ACAGCCAACTATGACCAG-3’，下游引物序列为：5’-TGCCACCAGGAACAGG-3’；内参β-actin的上游引物序列为5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3’，下游引物序列为5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’。反应条件为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性36 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环40次。

1.3.3 MMP-9活性测定： 电泳结束后：(1)将凝胶置于洗脱液中振荡洗脱2次，每次40 min；(2)将凝胶用漂洗液漂洗2次，每次20 min；(3)将凝胶置于孵育液中37℃孵育42 h。孵育结束后，经染色液染色3 h及脱色液脱色后，显示出Pro-MMP-9(92 k)和Active-MMP-9(82 k)为位于蓝色背景上的透亮带，扫描成像并以反转模式打印。

表2 各组小鼠不同时点血清MMP-9浓度

注：与健康对照组比较，aP<0.01；与本组0 h比较，bP<0.05，cP<0.01；与本组2 h比较，dP<0.05，eP<0.01；与本组4 h比较，fP<0.05；与对照亚组比较，gP<0.05，hP<0.01；与低剂量亚组比较，iP<0.05，jP<0.01

表3 各组小鼠不同时点血清MMP-9 mRNA表达

注：与健康对照组比较，aP<0.01；与本组0 h比较，bP<0.05；与本组2 h比较，cP<0.05；与本组4 h比较，dP<0.05；与对照亚组比较，eP<0.05，fP<0.01；与低剂量亚组比较，gP<0.05

2 结 果

2.1 小鼠血压变化 高血压组的收缩压和舒张压水平比健康对照组高，差异均有统计学意义(P<0.05)。小鼠腹腔注射不同剂量巴马司他后，高剂量亚组小鼠血压水平趋于恢复正常，与健康对照组比较，平均收缩压和舒张压差异无统计学意义(P>0.05)。低剂量亚组与对照亚组比较差异无统计学意义(P>0.05)；高剂量亚组与对照亚组及低剂量亚组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；结果表明，高剂量巴马司他能够改善高血压小鼠的血压水平。见表1。

表1 小鼠药物干预前后血压变化

注：与健康对照组比较，aP<0.05；与对照亚组比较，bP<0.05；与低剂量亚组比较，cP<0.05

2.2 小鼠血清MMP-9测定

2.2.1 MMP-9浓度： MMP-9蛋白浓度在高血压组小鼠血清中的水平显著高于健康对照组小鼠(P<0.01)。(1)组内比较：高剂量亚组和低剂量亚组小鼠血清中MMP-9蛋白表达水平均随着药物作用时间的延长而降低，不同时间点两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；而对照亚组无明显变化(P>0.05)。(2)组间比较：与低剂量亚组、对照亚组比较，高剂量亚组小鼠血清中MMP-9浓度在2 h、4 h、6 h时差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；低剂量亚组与对照亚组比较，各时间点差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.2.2 MMP-9 mRNA表达： 与健康对照组比较，高血压组MMP-9 mRNA水平显著升高(P<0.05)。(1)组内比较：高剂量亚组和低剂量亚组小鼠血清中MMP-9 mRNA水平均随着药物作用时间的增加而降低，不同时间点两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；而对照亚组无明显变化(P>0.05)。(2)组间比较：巴马司他降低高血压小鼠血清中MMP-9 mRNA的作用高剂量亚组、低剂量亚组、对照亚组间两两比较，差异均具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。以上结果表明，巴马司他能够抑制高血压小鼠血清中MMP-9 mRNA的水平。见表3。

2.2.3 MMP-9活性测定： 随着巴马司他给药剂量的增加，Pro-MMP-9和Active-MMP-9活性呈减弱趋势。表明巴马司他能够抑制高血压小鼠血清中MMP-9的活性。见图1。

注：1.健康对照组；2.对照亚组；3.低剂量亚组；4.高剂量亚组

3 讨 论

近年来，高血压的患病率不断提高，患病人数不断增加，严重影响着人类健康。高血压已成为多种心血管疾病的重要危险因素，并影响重要脏器如心、脑、肾的功能，最终可导致这些器官的功能衰竭[7]。大多数高血压患者没有任何症状，只有极少一部分患者有头晕和头痛的表现，导致了我国高血压的低知晓率、低治疗率以及低控制率[10]。

巴马司他是一种广谱基质金属蛋白酶抑制剂，通过抑制细胞外基质的降解，进而抑制动脉损伤后血管平滑肌细胞的激活及迁移。目前普遍研究认为，长期高血压、高血压心脏病、高血压肾病、血管重构以及动脉粥样硬化，均能够引起MMPs/TIMPs的失衡[7]。研究发现，高血压患者颈动脉粥样斑块内MMP-9活性较血压正常的患者增加，MMP-9在心血管疾病中扮演重要的角色[11]；有研究认为血浆TIMP-1水平>1 200 μg/L是高血压患者发生充血性心力衰竭的先兆[12]。研究表明，单纯收缩期高血压患者和正常人均可发生同MMP-9相关联的动脉硬化，MMP-9可能参与了动脉硬化和单纯收缩期高血压进展的过程[5]。另有研究显示MMP-9可能在高血压血管重构的早期阶段起着关键作用。可见，MMPs/TIMPs失衡在这些疾病的发生和发展过程中起着重要的作用。

本研究选取自发性高血压小鼠模型，探讨外源性基质金属蛋白酶9抑制剂巴马司他对高血压小鼠及其血清中MMP-9水平和活性的影响。经RT-PCR和ELISA分析，发现高剂量亚组和低剂量亚组小鼠血清中MMP-9 mRNA及其蛋白表达水平均随着药物作用时间的增加而降低；高剂量亚组药物作用6 h后，MMP-9表达接近正常水平；高剂量亚组和低剂量亚组组间比较，MMP-9表达具有统计学差异；表明巴马司他能够抑制高血压小鼠血清中MMP-9的表达，且具有药物作用的时间和剂量依赖性。明胶酶谱实验结果表明，巴马司他同时能够抑制高血压小鼠血清中MMP-9的活性，可能通过影响MMP-9分子功能来抑制MMP-9在高血压中作用。给药结束后血压测定发现，高剂量巴马司他能够显著降低高血压小鼠的血压水平；与正常小鼠相比，平均收缩压和平均舒张压差异无统计学意义。因此，巴马司他可能通过降低高血压小鼠血清中MMP-9的表达和活性来降低小鼠血压水平，为临床上巴马司他降压作用的研究提供了理论基础。结合已有MMPs/TIMPs在高血压方面的深入研究，可以通过直接或间接抑制MMP-9，同时调节MMPs/TIMPs系统来达到治疗高血压的目的。

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Effectofbatimastatonhypertensionmiceanditsserummatrixmetalloproteinase9

LIHui,PENGLijing,LIUWei,YEMingxia,TUOBuxiong.

DepartmentofCardiology,the451thHospitalofPeopleLiberationArmy,Xi'an710054,China

TUOBuxiong，E-mail：swattl@126.com

ObjectiveTo study the effect of matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) inhibitor batimastat on blood pressure, serum MMP-9 level and activity in hypertension mice.MethodsThirty-six hypertension (hypertension group) mice were divided into 3 groups, with 12 rats in each group, give 3 days of high dose of batimastat (30 mg/kg, high dose group), low dose of batimastat (10 mg/kg, low dose group) and physiological saline (control group) injection on mouse peritoneal in the three groups respectively, the serum levels of MMP-9 and mRNA levels were detected followed in the 1 last after injection 0 h, 2 h, 4 h, 6 h; serum levels of MMP-9 activity were detected by gelatin zymography assay. Select 36 healthy mice as healthy control group, serum levels of MMP-9 and mRNA levels were detected, and compared with hypertension group.Results(1) Blood pressure change: compared with health control group, hypertension group before treatment blood pressure is higher, the difference was statistically significant (P<0.05), after treatment, compared with the control group and low dose group, high dose group blood pressure decreased, the differences were statistically significant (P<0.05). (2) The serum concentration of MMP-9: compared with health control group, before treatment, in the hypertension group, MMP-9 protein levels were significantly higher (P<0.01), after treatment, the within group comparisons: in high dose group and low dose group, the expression of MMP-9 protein in the serum of mice were decreased along with prolonging the time of drugs, the differences were statistically significant (P<0.05,P<0.01); compared with control group and low dose sub group, high dose group's serum MMP-9 concentration was low at 2 h,4 h,6 h,the differences were statistically significant (P<0.05,P<0.01); compared between low dose group and control group, 2 h, 4 h, 6 h the difference had statistical significance (P<0.05). (3) The expression of MMP-9 mRNA: compared with health control group, hypertension group MMP-9 mRNA was elevated (P<0.05); after treatment, high dose group and low dose group of mice' level of serum MMP-9 mRNA were decreased with the increase of drug action time, differences were statistical significance (P<0.05,P<0.01); paired compassion of low dose sub group, high dose sub group, control sub group showed significant differences (P<0.05,P<0.01). (4) Determination of MMP-9 activity: with the batimastat dose increased, Pro MMP-9 and Active MMP-9 activity decreased.ConclusionBatimastat can reduce blood pressure level and serum MMP-9 level and activity of high blood pressure mice.

Batimastat; Matrix metalloproteinase 9;Hypertension；Mice

710054 西安，解放军第四五一医院心血管内科

拓步雄，E-mail：swattl@126.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.07.020

2014-03-21)