黄疣海参皂苷hillaside A和hillaside B的体外抗真菌及抗肿瘤活性*

张佳佳 ，朱可奇，巫 军，王开义

（1.浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 315200； 2.浙江省宁波市第一医院，浙江 宁波 315010；3.宁波生物医药技术有限公司，浙江 宁波 315800）

黄疣海参 Holothuria（Thymiosycia）hilla，属棘皮动物门（Echinodermata）海参纲（Holothuroidea）木盾手目（Aspidochirotida）海参科（Holothuriidae）海参属（Holothuria），分布于西太平洋及孟加拉湾以东之印度洋海域，在我国南海珊瑚礁区有大量分布[1]。笔者对其体内的皂苷类成分进行了较系统的研究，本研究中报道从黄疣海参体内分离得到的海参皂苷hillaside A和hillaside B的抗真菌及抗肿瘤活性。

1 仪器、试药与样本

Varian Inova－600型核磁共振仪；Bruker Vector 22型红外光谱仪；Sephadex－LH－220（Pharmacia 公司）；Quatrro 质谱仪（Micromass公司）XT5型显微熔点仪（温度未校正，北京市科仪电光仪器厂）；HPLC仪，包括 Aglient 1100 Series，RID检测器（Aglient公司）。HPLC洗脱剂为色谱纯甲醇；其余试剂均为分析纯。MJX－350S型智能霉菌培养箱（无锡亿虹实验设备有限公司）；THZ－82A型台式恒温振荡器（上海百典仪器设备有限公司）；RT－2100C型酶标分析仪（北京普朗仪器有限公司）。

DMEM培养基（美国Gibco公司）；磺酰罗丹明B（sulforhodamine B，SRB）、Tris base unbuffer和三氯醋酸 （TCA）均购自Sigma公司；注射内环磷酰胺（上海华联制药集团）；细胞株为国际通用的肿瘤细胞株(上海生物化学所细胞库)；ATCC标准株（上海长征医院菌种保存中心）；临床株（浙江医学科学院药理研究中心）。阳性对照品氟康唑（fluconazole）和酮康唑（ketoconazole）由第二军医大学药学院有机化学教研室提供。

黄疣海参采集于福建省东山岛附近海域，采集时间2010年9月，经中国海洋大学海洋化学教研室鉴定，标本现存放于浙江医药高等专科学校海洋药物实验室。

2 方法与结果

2.1 提取、分离及结构鉴定

将新鲜采集的黄疣海参（65 kg）洗净、绞碎，用95%乙醇回流提取3次，醇提物分散于水中，用石油醚反复脱脂多次，水相用正丁醇萃取3次后浓缩至3 000 mL，用3 000 mL水反复洗涤去除盐、多糖等强极性成分，减压蒸干得浅棕黄色固体145 g。

取100 g用硅胶低压柱色谱处理，以氯仿－甲醇－水（8∶2.5∶1，下层）洗脱，得到的主成分用高效液相柱色谱纯化，洗脱剂为80% 甲醇，体积流量为 1.0 mL／min，色谱柱为 Zobax SB C18型ODS反相柱[2]，得到 2个化合物，其中化合物Ⅰ为 hillaside A（31.7 mg），化合物Ⅱ为 hillaside B（34.6 mg ）。

主要应用现代波谱技术（IR，高分辨 2D－、3D－NMR，ESIMS，CD等）和化学手段（酸水解、酶解、脱硫、甲基化、乙酰化、还原等）鉴定以上2个化合物的结构，其均为新的三萜皂苷类化合物，化合物Ⅰ命名为 hillaside A(C41H63O17Sna)，化合物Ⅱ命名hillaside B(C41H65O17Sna)。

2.2 抗肿瘤生物活性体外筛选

采用磺酰罗丹明B蛋白染色法（SRB法）[3]。根据肿瘤细胞生长速率，将处于对数生长期的肿瘤细胞以90 μL／孔接种于96孔培养板，贴壁生长24 h，再加入样品溶液10 μL／孔。每个浓度设3复孔。并设相应浓度的0.9%氯化钠溶液溶剂对照及细胞调零孔。肿瘤细胞在37℃，5%CO2条件下培养72 h。药物作用时间终点时，每孔加入50 μL 4℃预冷的TCA溶液（30%，W／V）固定细胞，TCA溶液的终浓度为10%，静置5 min移入4℃冰箱中固定1 h，取出用去离子水冲洗5遍，室温晾干。待96孔板室温下晾干后，每孔加入0.4%（W／V）的 SRB染液（1%的乙酸配制）70 μL，染色 30 min后倒掉染液，用1%（V／V）乙酸冲洗4次，去除未结合的染料，室温晾干。用100 μL非缓冲 Tris－base碱液（10 mM，pH ＝10.5）溶解与细胞蛋白结合的染料，水平摇床上振荡20 min，采用酶标仪540 nm处测定。按公式[肿瘤抑制率＝（对照组 OD值－治疗组 OD值）／对照组OD值×100%][4]计算被测物对癌细胞生长的抑制率，采用Logit法计算半数抑制量(IC50值)。结果表明，黄疣海参皂苷单体化合物hillaside A和hillaside B对受试的10个肿瘤细胞株均显示很强的细胞毒活性[5]，IC50值为 0.15 ～ 3.20 mg／L，见表 1。

表1 hillaside A和 hillaside B体外抗肿瘤活性（IC50，μg／mL）

2.3 抗真菌活性研究

2.3.1 培养液和培养基培植

RPMI 1640 培养液：将 RPMI 1640 （Gibco BRL）10 g，NaHCO32.0 g，吗啡啉丙磺酸（MOPS，Sigma） 34.5 g （0.165 mol／L），依次溶解于 900 mL的三蒸水中，在 25℃的条件下用 1 mol／L的NaOH中和，调节 pH调至 7.0，定容至1 000 mL，滤除杂菌，4℃保存。

沙堡葡萄糖琼脂培养基（SDA）：蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，琼脂18 g，加三蒸水900 mL溶解，加入2 g／L氯霉素水溶液50 mL，调整pH至7.0，定容至1 000 mL，高压灭菌后4℃保存。

YEPD培养液：酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，加三蒸水900 mL溶解，加入2 g／L氯霉素水溶液50 mL，定容至1 000 mL，高压灭菌后4℃保存。

2.3.2 菌液制备

试验前，用接种圈从4℃保存的SDA培养基上挑取白色假丝酵母菌、新生隐球菌、近平滑念珠菌和热带念株菌等球状菌少量，接种至1 mL YEPD培养液，于35℃，250 r／min振荡培养，活化18 h，使真菌处于指数生长期；再取该菌液10 μL至1 mL YEPD培养液中，用上述方法再次活化；18 h后，用血细胞计数板计数，以RPMI 1640培养液调整菌液浓度至1×103～5×103个／mL。将丝状菌接种至SDA斜面，其中皮下组织真菌和系统性真菌（申克孢子丝菌、烟曲霉菌）35℃，培养1周；浅表真菌（红色毛藓菌）28℃，培养2周，各菌种活化2次。

2.3.3 药液制备

用二甲基亚砜将待测药物配成质量浓度为28.3 g／L的溶液，－20℃低温保存，试验前，将药液取出置，置于35℃温箱中融化备用。

2.3.4 药敏板制备

采用96孔U型板，每排1～10孔依次加入不同质量浓度待测药物工作液100 μL，第1孔为最高浓度，第10孔为最低浓度。制备好的药敏板可用塑料薄膜包裹后置－70℃保存6个月以上。取制备好的药敏板，在1～10孔加入100 μL菌工作液，第11孔中加入 100 μL无菌蒸馏水和100 μL菌工作液，作为生长对照；第12孔仅加入无菌不含药物培养基作阳性对照。

2.3.5 MIC 值判定

假丝酵母菌、新生隐球菌及丝状真菌分别于35℃孵育24 h，72 h和1周后，用酶标分析仪于620 nm测各孔 OD值。与阳性对照孔比，以 OD值下降80%以上的最低浓度孔中药物浓度为MIC80（真菌生长80%被抑制时的药物浓度）。

当药物的 MIC80值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计： MIC80值高于最高浓度 32 μg／mL 时，计为“＞ 256 μg／mL”；MIC80值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤0.25 μg ／mL”。

上述试验平行操作2次至3次，当 MIC80值能准确重复或只差1个浓度时才被接受，并以较高浓度作为 MIC80值；当 MIC80值相差2个浓度以上时，则需重新试验，直到符合要求为止。

2.3.6 结果

采用微量液基稀释法[6]，以酮康唑和氟康唑作为阳性对照，分别测定了黄疣海参提取物hillaside A和hillaside B对7种临床常见致病真菌的体外抑菌活性，各菌株对样品的敏感性以 MIC80值表示，见表2。结果表明，hillaside A和hillaside B对7种真菌表现出强的活性，MIC80值均小于8 μg／mL，有进一步研究的价值。

表2 hillaside A和 hillaside B的体外抗真菌活性(MIC80，μg／mL)

3 讨论

具有促微管聚合活性的hillaside A和hillaside B与目前已知的6类微管稳定剂显示完全不同的化学结构特征，这对目前微管稳定剂均具有相似药效基团的认识可能是一个挑战。此外，与已知微管稳定剂水溶性差、给药途径受限相反，这2种成分均具有良好的水溶性，如果进一步的研究能确证其微管稳定和抗肿瘤活性，将具有较大的开发应用价值，并可能对微管稳定剂的构效关系研究和传统筛选方向产生深远影响。

[1]易杨华，李 玲，汤海峰.海洋药物导论[M].上海：上海科学技术出版社，2004：2.

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[3]Mani S，Macapinlac M Jr，Goel S，et al.The clinical development of new mitotic inhibitors that stabilize the microtubule[J] .Anticancer Drugs，2004，15（6）：553 － 558.

[4]汤海峰，易杨华，张淑瑜，等.海星皂苷的研究进展[J].中国海洋药物，2004，23（6）：48 － 57.

[5]Hu W，Dong H，Li YZ，et al.A high － throughput model for screening antitumor agents capable of promoting polymerization of tubulin in vitro[J].Acta pharmacologica Siniac，2004，25（6）：775 － 782.

[6]张佳佳，巫 军.黑乳海参皂苷nobilisideⅠ和nobilisideⅡ的体外抗真菌及抗肿瘤活性[J].中药材，2011，34（9）：1 420 － 1 423.