硼替佐米对胰腺癌细胞BxPC3、SW1990生长抑制作用的体外研究

黎美琳 周春华 王少峰

蛋白酶体抑制剂硼替佐米(万珂，velcade)是一种新型抗肿瘤制剂，由于其对血源性恶性肿瘤的突出效应，已被美国食品药品管理局(FDA)批准用于反复性或顽固性的多发性骨髓瘤治疗[1]。近年来的研究发现，硼替佐米对大部分肿瘤具有抗癌活性，包括小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌等。硼替佐米与化疗药物联用治疗实体肿瘤的Ⅰ期、Ⅱ期临床试验也取得初步进展[2]。体内和体外实验研究结果均显示硼替佐米单药或联合其他化疗药物可杀伤胰腺癌细胞，抑制肿瘤的生长[3-4]，但不同癌细胞对硼替佐米的敏感性差异甚大[5]，且与治疗敏感性相关的分子机制研究鲜有报道。本研究应用硼替佐米干预胰腺癌细胞BxPC3、SW1990，观察其对癌细胞增殖、凋亡的影响，探讨硼替佐米杀伤癌细胞及其敏感性的可能机制。

材料与方法

一、材料

人胰腺癌细胞株BxPC3、SW1990购自上海生命科学院细胞库；硼替佐米由西安杨森公司提供；四甲基偶氮唑盐(MTT)为Sigma公司产品；Trizol RNA提取试剂、凋亡检测试剂盒购自Introvinent公司；cDNA逆转录试剂盒为Fermentas公司产品，SYBR Green Mix for Q-PCR 为ABI公司产品；兔抗人survivin、caspase、cleaved-caspase、Bcl-2的IgG及鼠抗人GAPDH IgG，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔及羊抗鼠IgG均购自Cell Singaling Technology公司。

二、方法

1．细胞增殖检测：采用MTT法检测细胞增殖。取对数生长期细胞，胰酶消化后制备成单个细胞悬液，调整细胞密度至5×104/ml，取100 μl接种于96孔板培养过夜，分别加入1、10、50、100、500 nmol/L及1、10 μmol/L的硼替佐米，以不加硼替佐米为对照组，不加细胞为空白组，分别孵育24、48、72 h，加入10 μl MTT(5 mg/L)避光孵育4 h，弃上清，每孔加150 μl DMSO，振荡摇匀，置酶标仪测各孔490 nm的吸光度值(A490值)。每组设3个平行孔。细胞存活率(%)=(实验组A490值-空白组A490值/对照组A490值-空白组A490值)×100%。

2．细胞凋亡检测：采用Annexin V/PI双染色，流式细胞仪检测细胞凋亡。细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔板，孵育过夜，分别加入10、50、100 nmol/L的硼替佐米孵育48 h，以不加硼替佐米为对照组。孵育后收集细胞，PBS洗涤2次，用1× binding buffer 1 ml重悬细胞，取100 μl细胞悬液加入5 μl Annexin V-FLTC和1 μl PI(100 μg/ml)，室温避光放置15 min，再加入400 μl 1× binding buffer，混匀后上流式细胞仪检测。

3．凋亡相关基因Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-xl、survivin mRNA表达检测：采用RT-PCR法检测mRNA的表达。取10、100 nmol/L硼替佐米干预48 h的细胞及未经硼替佐米干预的对照组细胞，用Trizol提取细胞总RNA。引物序列：Bax上游5′-GGGGACGAACTGGACAGTAA-3′，下游5′-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3′，产物122 bp；Bak上游5′-GCTATGACTCAGAGTTCCAGACCA-3′，下游5′-CAATTGATGCCACTCTCAAACAG-3′，产物111 bp；Bcl-2上游5′-TTTGAGTTCGGTGGGGTCAT -3′，下游5′-TTCAGAGACAGCCAGGAGAAAT-3′，产物203 bp；Bcl-xl上游5′-GTAAACTGGGGTCGCATTGT-3′，下游5′-TGCTGCATTGTTCCCATAGA-3′，产物197 bp；survivin上游5′-AGGACCACCGCATCTCTACAT-3′，下游5′-AAGTCTGGCTCGTTCTCAGTG-3′，产物118 bp；内参GAPDH上游5′-GTGGTCTCCTCTGACTTCAAC-3′，下游5′-TCTCTTCCTCTTGTGCTCTTG-3′，产物212 bp。引物序列由上海生工生物技术有限公司设计合成。先按照Fermentas试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA，然后行PCR扩增。PCR条件：95℃ 5 min，50℃(Bax)或52℃(Bcl-xl)或55℃(Bak、Survivin、GAPDH)或56℃(Bcl-2) 30 s、72℃ 60 s，30个循环，最后72℃延伸10 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，图像分析仪扫描，以目的条带与内参条带灰度值比表示mRNA的相对表达量。

4．Pro-caspase-3、cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2、surviving蛋白表达检测：收集上述各组细胞，裂解后离心，取上清，蛋白定量。取50 μl常规行蛋白质印迹法检测pro-caspase-3、cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2、surviving蛋白的表达，以GAPDH为内参，最后ECL发光，压片，曝光，图像分析仪扫描。以目的条带与内参条带灰度值比表示蛋白相对表达量。

三、统计学处理

结 果

一、BxPC3、SW1990细胞增殖的变化

大于50 nmol/L的硼替佐米呈浓度及时间依赖性抑制胰腺癌BxPC3、SW1990细胞的增殖，其中硼替佐米对BxPC3细胞的生长抑制作用显著大于对SW1990细胞的作用，两者差异有统计学意义(P值均<0.05，表1)。

二、BxPC3、SW1990细胞凋亡的变化

对照组及10、50、100 nmol/L硼替佐米干预48 h的BxPC3细胞凋亡率分别为(2.15±0.47)%、(2.36±1.15)%、(10.52±1.05)%、(22.56±4.23)%；SW1990细胞凋亡率分别为(2.32±0.54)%、(2.27±1.37)%、(6.23±0.34)%、(12.71±2.23)%(图1)。

表1 硼替佐米干预BxPC3、SW1990细胞后的细胞存活率

横坐标为Annexin V-FLTC荧光强度；纵坐标为PI荧光强度

50、100 nmol/L硼替佐米组凋亡率均显著高于对照组(t值分别为-12.595、-7.942和-10.535、-7.857，P值均<0.05)，且BxPC3细胞的凋亡率显著高于SW1990细胞(t值分别为6.715、3.443,P值均<0.05)。

三、BxPC3、SW1990细胞凋亡相关基因mRNA表达水平的变化

10、100 nmol/L硼替佐米处理48 h后，两种胰腺癌细胞Bak mRNA的表达量无显著变化；Bax mRNA的表达量较相应对照组均显著升高(F值分别为207.802、61.532，P值均<0.05)；Bcl-2、Bcl-xl mRNA的表达量均较相应对照组显著下降(F值分别为194.249、116.067和48.931、145.512，P值均<0.05)；survivin在BxPC-3细胞中表达下调(F=76.877，P<0.05)，在SW1990细胞中表达上调(F=103.244，P<0.05，图2、表2)。

四、BxPC3、SW1990细胞凋亡相关基因蛋白表达水平的变化

10、100 nmol/L硼替佐米干预后，BxPC3、SW1990细胞pro-caspase-3表达减弱(F值分别为257.098、384.099，P值均<0.05)，cleaved-caspase-3表达增强(F值分别为295.561、48.735,P值均<0.05)，Bax蛋白表达增强(F值分别为116.233、207.271，P值均<0.05)，Bcl-2蛋白表达减弱(F值分别为233.143、428.702，P值均<0.05)，组间差异均有统计学意义；survivin蛋白在BxPC3细胞表达明显减弱(F=3512.366，P<0.05)，而在SW1990细胞中持续高表达(F=45.265，P<0.05，图3、表2)。

图2 0、10、100 nmol/L硼替佐米作用48 h后BxPC3和SW1990细胞相关基因mRNA表达

图3 0、10、100 nmol/L硼替佐米作用48 h后BxPC3和SW1990细胞相关蛋白表达

表2 硼替佐米处理后两种胰腺癌细胞凋亡相关基因mRNA和蛋白表达量

讨 论

硼替佐米可诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长，其机制主要包括以下几个方面[6-7]：(1)抑制NF-κB信号通路的激活；(2)增加细胞内抑癌基因p53、p21、p27的表达；(3)诱导线粒体内源性凋亡途径；(4)激活死亡受体外源性凋亡信号；(5)内质网介导的凋亡信号激活。

Bcl-2蛋白家族可分为抗凋亡成员和促凋亡成员，后者仅BH3域具有同源序列。细胞在应激状态下，同源BH3结构域的促凋亡蛋白作为感应元件，直接抑制抗凋亡蛋白和(或)激活Bax类促凋亡蛋白，增加线粒体膜通透性，释放细胞色素C，激活caspase-3，诱导其联级反应致细胞凋亡[8]。Bcl-2家族的抗凋亡蛋白持续高表达在恶性肿瘤发生、发展过程中起重要作用[9]。本研究结果显示，硼替佐米抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，Bcl-2、Bcl-xl表达减弱，Bax表达增强，caspase-3裂解激活，提示硼替佐米干预细胞后可能通过抑制抗凋亡蛋白、增强促凋亡蛋白表达，诱导线粒体途径凋亡的发生。本研究的两株癌细胞Bak表达无显著变化，可能与Bak主要表达于胰腺癌组织周围慢性炎性区域，参与此部位细胞凋亡而非肿瘤细胞本身有关[10]。

Survivin是凋亡蛋白抑制因子家族成员之一，通过与caspase-3和caspas-7结合而抑制caspase联级反应，从而抑制细胞凋亡的发生。survivin主要表达于胚胎和发育的胎儿组织，在分化成熟的正常成人组织中几乎不表达。多项研究表明，survivin与肿瘤的发生、发展，放、化疗的抵抗性以及预后不良有关。Vaziri等[11]研究表明，硼替佐米诱导的p53+/+表型的HCT116结肠癌细胞的凋亡增加与survivin表达下调相关。但Liu等[12]报道，硼替佐米诱导的非小细胞肺癌细胞株凋亡却伴随survivin表达升高。最新研究报道，硼替佐米杀伤结肠癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤等肿瘤细胞的敏感性与survivin表达呈负相关。抑制survivin表达可逆转肿瘤细胞对硼替佐米的抵抗性[5]。本研究结果显示，对硼替佐米敏感性高的BxPC3细胞的survivin表达明显低于对硼替佐米敏感性低的SW1990细胞，提示survivin高表达可能在硼替佐米肿瘤抵抗中起作用。

参 考 文 献

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