响应面法优化大豆中植物甾醇的超声提取工艺

（吉林大学生物与农业工程学院，吉林长春 130022）

植物甾醇是一种结构上类似于胆固醇的植物活性成分，目前经过鉴定的植物甾醇单体有250多种，最常见的五种成分是β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾烷和菜油甾烷，其中含量较多的是β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾烷、菜油甾烷等，主要存在于油脂、豆类食物中[1-2]。由于其具有降胆固醇、降血脂、抑制肿瘤和抗氧化[3-8]等作用，在医药和食品工业有广泛的应用。2000年美国FDA批准添加植物甾醇的食品可采用“健康声称”标签，2003年欧盟食品科学委员会（SCF）亦确证植物甾醇类食品的安全性。因此对植物甾醇的研究具有广阔的市场前景。

目前植物甾醇的提取主要有回流法、溶剂法、微波辅助法、超声辅助法等。其中回流法和溶剂法需要使用大量的萃取溶剂且萃取时间长，而微波易导致溶液沸腾损失，因此本文采用超声辅助法对大豆甾醇提取工艺进行研究。

张泽生[9]、夏秋敏[10]、王丽波[11]和万茵[12]等学者分别对米糠、苹果籽、南瓜籽和栀子进行了甾醇提取研究，尚未见从大豆中提取甾醇的研究报道。我国是大豆的起源地，也是全球保存栽培大豆种质资源数量最多的国家，至今已收集保存3万余份大豆资源；大豆产区主要在东北和黄淮海地区，2008年全国大豆播种面积达950万公顷。而且大豆中甾醇含量高于青豆、黑豆和绿豆等[7]，因此本文采用响应面法[13]优化大豆中植物甾醇的超声提取工艺，为大豆甾醇的工业化开发提供理论依据。

1 试验材料、仪器设备和方法

1.1 材料与试剂

大豆：2012年2月购于吉林省长春市农贸市场。

β-谷甾醇：分析标准品（＞95%），阿拉丁试剂（中国）有限公司。

1.2 仪器与设备

KQ-250DB型超声波清洗仪：江苏省昆山市超声仪器有限公司；FW177型中草药粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；MM721AAU-PW美的微波炉：美的微波电器制造有限公司；LD4-2A型低速离心机：北京市雷勃尔离心机有限公司；AL104型电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；T22N紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆中植物甾醇的几种提取工艺

每次称取3.00 g经粉碎120 s～150 s的大豆粉，置于250mL带塞锥形瓶中，按照20∶1（mL/g）液料比加入80%乙醇。工艺A：将锥形瓶置于45℃恒温水浴锅中低速振荡2 h；工艺B：进行119 W微波15 min；工艺C：进行250 W超声40 min；工艺D：先进行119 W微波10 min，后进行250 W超声30 min；工艺E：先进行250 W超声30 min，后进行119 W微波10 min。经过上述提取工艺后，进行4 000 r/min离心5 min，取上清液测定总甾醇含量。

1.3.2 大豆中植物甾醇的超声提取

每次称取3.00 g经粉碎120 s～150 s的大豆粉，置于250 mL带塞锥形瓶中，加入80%乙醇进行超声提取。然后进行4 000 r/min离心5min，取上清液测定总甾醇含量。

1.3.3 试验指标及方法

总甾醇含量的测定：参照文献[14] 中的硫磷铁法。

1.4 数据分析

每次提取试验重复两次，采用Excel 2003软件计算，取平均值及标准偏差。应用Design Expert 8.0.5软件进行Box-Behnken响应面试验设计（BBD），并进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 β-谷甾醇标准曲线的建立

参照文献[14] 中的硫磷铁法，建立β-谷甾醇标准曲线。经Excel 2003软件计算，得到回归方程y=5.467x+0.004，式中y为吸光度值，x为β-谷甾醇溶液浓度（mg/mL）；该方程相关系数R2=0.998 6，说明曲线回归性很好，可以用于定量分析。

2.2 大豆中植物甾醇提取工艺的比较

大豆粉在不同工艺条件下进行提取，试验方法见1.3.1，试验结果见图1。

图1 大豆中植物甾醇不同提取工艺的比较Fig.1 Comparison of different extraction process of phytosterols from soybean

由图1可知，采用119W微波15min或250W超声40min进行提取，总甾醇提取率分别为（3.91±0.04）mg/g、（4.02±0.23）mg/g，与45℃水浴2h的提取率（4.04±0.63）mg/g接近，提取时间却分别缩短了87.5%、66.7%。因此，超声法、微波法是较好的提取方法。

另外用乙醇作为提取溶剂，在119 W微波15 min后，乙醇体积损失了40%。同时，采用先超声30 min后续微波10 min提取的总甾醇提取率（4.55±0.29）mg/g比单独超声 40 min的提取率（4.02±0.23）mg/g稍高，但考虑到工艺的方便性，选择超声波法（工艺C）提取大豆中植物甾醇。

2.3 大豆中植物甾醇超声提取的单因素试验结果及分析

2.3.1 超声时间对总甾醇提取率的影响

大豆粉以20∶1（mL/g）液料比在超声功率250 W下分别提取 20、30、40、50、60、70 min，试验结果见图2。

图2 超声时间对总甾醇提取率的影响Fig.2 Effects of ultrasonic time on the total phytosterols extraction rate

由图2可知，从20 min～40 min总甾醇提取率随时间的延长而增加；当提取时间为40 min时，总甾醇提取率达最大；从40 min～70 min总甾醇提取率随时间的延长而缓慢减少。

2.3.2 超声功率对总甾醇提取率的影响

大豆粉以20∶1（mL/g）液料比分别在超声功率为125、150、175、200、225、250 W 下提取 40 min，试验结果见图3。

图3 超声功率对总甾醇提取率的影响Fig.3 Effects of ultrasonic power on the total phytosterols extraction rate

由图3可知，从125 W～175 W总甾醇提取率随着超声功率的增大而增加；从175 W～250 W总甾醇提取率增加的幅度不大。

2.3.3 液料比对总甾醇提取率的影响

大豆粉分别以10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g）液料比在超声功率250 W下提取40 min，试验结果见图4。

图4 液料比对总甾醇提取率的影响Fig.4 Effects of liquid to solid ratio on the total phytosterols extraction rate

由 4 可知，液料比从 10 ∶1（mL/g）～20 ∶1（mL/g）总甾醇提取率逐渐增加；从 20 ∶1（mL/g）～25 ∶1（mL/g）总甾醇提取率缓慢增加；从 25 ∶1（mL/g）～30 ∶1（mL/g）总甾醇提取率却略有下降。

2.4 Box-Behnken响应面法优化提取工艺

2.4.1 BBD试验及其结果分析

根据单因素试验结果，进行BBD优化甾醇超声提取试验，以总甾醇提取率（mg/g）为响应值y，其因素水平及编码见表1，试验方案及结果见表2～表3。

表1 自然因素水平编码表Table 1 Level code of natural factors

表2 BBD试验方案及结果Table 2 Results of BBD experiment

表3 响应面二次模型的方差分析Table 3 ANOVA for Response Surface Quadratic Model

通过Design Expert 8.0.5软件分析，得到关于编码因素的回归方程为：

y=3.52+0.26x1+0.20x2+0.25x3+0.12x1x2-0.012x1x3+0.015x2x3-0.13x12+0.076x22+0.025x32

由表3可知，方程的F值为11.43，大于F0.01（9，7）=6.71，说明拒绝零假设，即在显著性水平0.01下认为该回归方程是显著的；失拟项的F值为3.12，小于F0.25（3，4）=2.05，说明该方程是不失拟的，即拟合得好。此外，该回归方程的R2值为0.936 3，说明方程拟合得好。

2.4.2 响应曲面图及其分析

通过DesignExpert8.0.5软件分析，获得因素交互作用的响应曲面图（见图5～图7）。由响应曲面分析得到最佳工艺条件为：超声时间为40min、超声功率为200W、液料比为 25∶1（mL/g），此时总甾醇提取率为 4.33mg/g。采用上述工艺条件重复两次试验，测得的总甾醇提取率平均值为4.21mg/g。与理论预测值的相对误差为-2.74%，表明采用响应面法优化的工艺参数是可靠的。

图5 y=f（x1，x2）响应曲面图Fig.5 3D surface graph of y=f（x1，x2）

图6 y=f（x1，x3）响应曲面图Fig.6 3D surface graph of y=f（x1，x3）

图7 y=f（x2，x3）响应曲面图Fig.7 3D surface graph of y=f（x2，x3）

3 结论

1）采用溶剂法2 h、119 W微波15 min或250 W超声40 min进行大豆中植物甾醇的提取，三者总甾醇提取率接近，但后两者在提取时间上分别缩短了87.5%、66.7%；采用119 W微波15 min后乙醇体积损失了40%。从节约提取时间、减少溶剂损失的角度选择超声波法提取大豆中植物甾醇。

2）利用Box-Behnken响应面法建立了大豆中植物甾醇超声提取的回归方程（R2=0.936 3）：

y=3.52+0.26x1+0.20x2+0.25x3+0.12x1x2-0.012x1x3+0.015x2x3-0.13x12+0.076x22+0.025x32

3）通过响应面法优化得到大豆中植物甾醇超声提取的最佳工艺条件：超声功率200 W、超声时间40 min、液料比 25 ∶1（mL/g），在此条件下大豆中总甾醇提取率为4.33 mg/g；实际测定值与理论预测值的相对误差为-2.74%，二者基本吻合，为大豆甾醇的工业化提取应用提供参考。

[1] 韩军花,杨月欣,冯妹元,等.中国常见植物食物中植物甾醇的含量和居民摄入量初估[J] .卫生研究,2007,36(3):301-305

[2] 韩军花,冯妹元,王国栋,等.常见谷类、豆类食物中植物甾醇含量分析[J] .营养学报,2006,28(5):375-378

[3] 韩军花.植物甾醇的性质、功能及应用[J] .国外医学(卫生学分册),2001,28(5):285-291

[4] 庞敏,姜绍通.甾醇氧化特性及其在食品中应用研究进展[J] .食品科学,2010,31(23):434-438

[5] Hicks K B,Moreau R A.Phytosterols and phytostanols:Functional food cholesterol cholesterol busters[J] .Food technology,2001,55(1):63-67

[6] Almendingen K,Lia A.Presence of plant sterols in the diet and the hypocholesterolemic effects of plant sterols[J] .Tidsskr Nor Laegeforen,2000,120(22):2661-2665

[7] Blair S N,Capuzzi D M,Gottlieb S O,et al.Incremental reduction of serum total cholesterol and low-density lipoprotein cholesterol with the addition of plant stanol ester-containing spread to statin therapy[J] .Am J Cardiol,2000,86(1):46-52

[8] Egbert Hovenkamp,Isabelle Demonty,Jogchum Plat,et al.Biological effects of oxidized phytosterols:A review of the current knowledge[J] .Progress in Lipid Research,2008,47(1):37-49

[9] 张泽生,于卫涛.超声波法提取米糠中植物甾醇的工艺研究[J] .食品研究与开发,2007,28(1)43-46

[10] 夏秋敏,邓红,董利彩,等.超声波辅助提取苹果籽中植物甾醇的工艺研究[J] .安徽农业科学,2011,39(30):18754-18756

[11] 王丽波,庞丽萍,徐雅琴,等.超声波辅助法提取南瓜籽中植物甾醇的研究[J] .中国粮油学报,2011,26(11):62-64

[12] 万茵,付佳明,张丹,等.超声波技术提取栀子总甾醇工艺研究[J] .食品工业科技,2011,32(3):327-329

[13] 诸爱士,李庐川.响应面法优化菜籽毛油甾醇提取[J] .中国粮油学报,2011,26(7):63-67

[14] 刘蕾,陈星,李晓丽,等.分光光度法测定大豆总甾醇含量的研究[J] .中国油脂,2005,30(4):45-46