安徽省汉族人群Miltenberger血型调查分析

周 娟，吕 蓉，朱帮强，韩婷婷，刘 忠，4

MNS血型系统是第2个被发现的血型系统，其复杂程度仅次于Rh血型系统［1］。MNS系统包括一些变异的低频率抗原，这些抗原联系在一起组成Miltenberger血型系统，其中Mur抗原是该血型系统中最常见的一种抗原，在中国人中具有相对较高的频率。Miltenberger血型系统在输血医学中具有重要意义。有报道［2－3］表明，抗Mur抗体能引起严重的溶血性输血反应及新生儿溶血病，因此，对中国人群Miltenberger血型分布进行调查，评估因Miltenberger血型不配合引起输血反应的风险，有一定的临床意义。该研究采用序列特异性引物PCR(PCRSSP)法对安徽省2 660例汉族人群Miltenberger血型进行了检测，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 样本 随机选取安徽省血液中心2 660例非血缘关系的汉族无偿志愿献血者，经外周静脉采血5 ml并用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。标准标本和血清:Mur抗原阳性标本6份、阴性标本2份以及抗-Mur标准血清1份，均由中山市红十字中心血站提供。

1.2 主要试剂与仪器 ① PCR试剂:血液基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司，批号:M1218);dNTPs(批号:CBH801A)、DL2000 Marker(批号:B7001A)(大连TaKaRa公司);SYBR Green I核苷酸胶体染料(美国 Invitrogen公司，批号:416154);MgCl2、10 × PCR Buffer、AmpliTaq 金牌酶 (美 国 ABI公 司，批 号:R01012、R02959、R04816);测序反应及纯化试剂:ExoSAP-1T虾碱磷酸酶(美国Promega公司);BigDye V3.1测序试剂盒(美国ABI公司);② 主要仪器:Biophotometer型DNA浓度测定仪(德国Eppendorf公司);PCT-200 PCR扩增仪(美国MJ Research公司);PRISM 3730测序仪(美国ABI公司)。

1.3 引物 按照文献［4］设计并委托上海英俊生物技术公司合成包括GYP.Mur基因在内的序列特异性引物，测序引物同扩增引物。可以检测到Miltenberger血型系统的表型有 GP.Mur、GP.Hop、GP.Bun、GP.Hut、GP.HF，人类生长激素(HGH)基因引物作为对照，引物序列见表1。

表1 引物序列及扩增长度

1.4 基因组DNA提取 采用离心柱法，使用天根血液基因组提取试剂盒从EDTA抗凝血中提取基因组DNA，并通过DNA浓度测定仪对其浓度、纯度进行测定。

1.5 PCR-SSP法检测Miltenberger血型系统 ①PCR 扩增体系:反应总体积为 50 μl，其中含 2 μl模板 DNA，5 μl 10 × PCR Buffer，1.5 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L dNTPs，10 μmol/L 引物各 1 μl，Ampli-Taq金牌酶0.75 U。②PCR扩增条件:95℃预变性15 min;然后94℃变性20 s，65℃退火20 s，72℃延伸20 s，35个循环后72℃延伸10 min。③ 产物分析:取扩增产物10 μl与已加SYBR Green染料的6×Loading Buffer 2 μl混合，直接点样至2%琼脂糖凝胶(不含EB)，95 V电泳30 min，用凝胶成像仪观察结果并作出判断。

1.6 Mur血型血清学鉴定 采用盐水法，抗-Mur标准血清2滴，加3% ～5%PCR-SSP阳性标本的红细胞1滴，混匀，3 000 r/min离心18 s。若盐水法无凝集，再做凝聚胺法进一步加强，并观察结果。

1.7 测序验证 ① PCR扩增产物的纯化:在每5 μl PCR产物中加入2 μl ExoSAP-1T虾碱磷酸酶，消化条件为37℃ 30 min，80℃ 15 min，然后冷却至4℃。②PCR纯化产物的直接测序:PCR纯化产物为测序反应模板，使用BigDye V3.1测序试剂盒进行双向测序，测序引物即扩增引物;采用醋酸钠/乙醇法纯化测序PCR产物，取纯化产物上测序仪进行电泳测序，Sequencing Analysis软件进行序列分析。

2 结果

2.1 PCR-SSP检测Miltenberger血型系统 采用PCR-SSP法对2 660份献血者样本进行筛查，有24份阳性(0.9%)。扩增结果见图1。

图1 PCR-SSP产物电泳结果

2.2 血清学试验验证 盐水法检测PCR-SSP阳性标本的红细胞均与抗-Mur标准血清发生凝集反应，表明存在Mur抗原。

2.3 基因测序结果分析 应用特异性引物对24例阳性标本进行PCR扩增，扩增后产物进行测序，测序结果与GenBank中Miltenberger血型系统基因参照序列比较，结果与GenBank的JN201202序列(即GP.Mur序列)一致(图2)，表明这24例标本均为GP.Mur表型。

图2 阳性标本的测序情况

3 讨论

Miltenberger血型系统中Mur抗原的临床意义最大，而其在不同种族中的分布差异较大，在人类学研究中也是一个有用的工具。本组实验结果显示安徽省汉族人群GP.Mur表型频率为0.9%。GP.Mur表型在东南亚人群中有较高的频率，泰国人为9.7%，台湾一般人群平均频率为7.3%［5］。Mur抗原在我国不同地区的汉族人群中的频率分布有差异，在广州番禺地区的频率为7.16%［6］，上海市的频率为0.67%［7］。Mur抗原在我国一些少数民族地区的分布频率更高，调查发现在云南怒族的频率高达22.65%［8］，广西侗族、壮族分别占15.4%［9］和11.29%［10］。

Miltenberger血型系统存在11个低频抗原，即Mia、Vw、Hut、Mur、MUT、Hil、TSEN、MINY、Hop、Nob和DANE，这些抗原交叉组成11种不同表型，即GP.Vw、GP.Hut、GP.Mur、GP.Hop、GP.Hil、GP.Bun、GP.Nob、GP.Joh、GP.Dane、GP.HF 以及 GP.JL。Miltenberger血型系统产生的机制为血型糖蛋白A(GPA)和血型糖蛋白B(GPB)的基因发生重组，即GYP(A－B)、GYP(A－B－A)、GYP(B－AB)杂交基因所致，其编码基因GYPA、GYPB位于染色体4q28 －31［11］。GYP(A －B)杂交基因编码 GP.Hil和 GP.JL［12］。对于 GYP.Hil、GYPA 与 GYPB 的交换位点位于GYPA内含子3的5'端，而GYP.JL交换位点位于内含子3的3'端，并包括GYPB外显子4的 7 个核苷酸。GP.Vw、GP.Hut、GP.Nob、GP.Joh以及GP.Dane都是由GYP(A－B－A)杂交基因所编码［12］。在这些杂交基因中，GYPB假外显子不同大小(1～16 bp)的插入片段替换了相同数目GYPA外显子3的核苷酸。GYP(B－A－B)杂交基因所编码 GP.Mur、GP.Hop、GP.Bun 以及 GP.HF［12］。在这些杂交基因中，通常沉默的GYPB假外显子3表达。在亚洲人群中，Mur抗原是其中最常见的一种抗原。该抗原是由于GYPB的假外显子3的部分片段被同源GYPA的外显子3替代，从而形成GYP(B－AB)结构，导致外显子3的剪切位点被激活而表达Mur抗原，其特异的氨基酸序列为(34TPAHANE41)［13］。

由于Mur抗原在脐带血中有很好的表达，易引起新生儿溶血病，也可引起严重的输血反应。因此，在输血反应原因分析时应考虑Mur抗原抗体反应。Miltenberger血型的分布和献血者资料是建立当地红细胞库的前提。此外，Mur抗原在安徽省的频率较高，输入这种血型的血液是否产生抗体，需要后续的进一步研究来证实。

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