LY294002靶向抑制PI3K/Akt信号通路干预K562细胞增殖的研究

耿英华，武文娟，于北凯，夏瑞祥

Akt是一类调节细胞凋亡与存活的胞质信号转导蛋白，生理状态下，Akt以低活性存在于细胞质中，当各种因素刺激时，Akt在PI3K作用下发生磷酸化而激活［1］。活化的Akt可促进细胞的生存、增殖、转移以及血管的形成。研究［2－3］表明，Akt在人类多种肿瘤中常被过度活化，如在胃肠道肿瘤、胰腺癌等组织中均高表达及活化。肿瘤细胞中Akt的活化与肿瘤细胞增殖、凋亡密切相关。Akt磷酸化可被PI3K特异性抑制剂LY294002［4］所抑制。该研究以慢性髓系白血病细胞株K562为研究对象，观察LY294002对K562细胞增殖的影响并探讨其相关机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人慢性髓系白血病细胞株K562由蚌埠医学院临床检验诊断学实验中心冻存。培养条件:含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，同时加入100 U/L链霉素和100 U/L青霉素，于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。每2～3 d传代1次。实验时，取对数生长期细胞。

1.2 主要试剂 RPMI 1640培养基(美国Gibco公司);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司);MTT、DMSO(美国Sigma公司);总RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒、PCR试剂盒、DNA Marker(北京天根生化科技有限公司);LY294002、PI单染周期检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);Skp2、GAPDH引物(南京金斯瑞生物科技有限公司);β-actin、Skp2鼠抗人单克隆抗体、山羊抗小鼠二抗(美国Santa Cruz公司);细胞培养板(美国Corning公司)。

1.3 MTT比色法测定 取对数生长期K562细胞，调节细胞浓度为5×104/ml，每孔100 μl种植于96孔培养板中。实验组LY294002终浓度分别为2.5、5、10、20、40、60 μmol/L，每个浓度设 3 个复孔，同时设阴性对照组和空白调零组，在37℃、5%CO2条件下培养24、48 h后，每孔加MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，继续孵育 4 h 后终止培养，加 DMSO 150 μl/孔，室温振摇10 min后，于波长570 nm处读取吸光度(OD)值。取3孔OD值的均数按公式计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率(%)=(1－OD实验组/OD对照组)×100%

1.4 流式细胞术检测细胞周期 常规培养K562细胞，取对数生长期细胞调节细胞浓度为5×104/ml，2 ml每孔接种于6孔培养板，分对照组、LY294002终浓度为10、20 μmol/L的实验组。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养36 h，收集细胞，预冷PBS洗涤1次，离心去除PBS，加入预冷的70%乙醇溶液固定细胞12～24 h，离心弃去固定液，PBS洗涤1次后收集细胞于流式管，每管细胞样品中加入预先配置好的含有RNase A和PI的染色液0.5 ml，缓慢并充分重悬细胞，37℃避光孵育30 min，随后冰浴放置并用BD流式细胞仪在488 nm激发波长下检测红色荧光和光散射情况，Flowjo软件分析细胞周期。

1.5 RT-PCR法检测Skp2 mRNA表达 取对数生长期 K562细胞接种于6孔板，分对照组、LY294002终浓度为10、20 μmol/L的实验组。用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养36 h，收集细胞。按照试剂盒说明提取总RNA，检测RNA提取纯度及浓度，每组取2 μg RNA进行逆转录，并对各组细胞的目的基因Skp2和内参基因GAPDH进行PCR扩增。扩增条件为94℃预变性5 min;94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，32个循环;72℃延伸10 min。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，BIO-RAD凝胶成像仪检测条带并分析灰度值，计算各组Skp2 mRNA相对量。实验重复3次。见表1。

表1 待测基因的PCR引物序列及扩增片段长度

1.6 Western blot法检测Skp2蛋白表达的变化取对数生长期K562细胞接种于6孔板，分对照组、LY294002终浓度为 10、20 μmol/L的实验组，培养36 h后收集细胞，加蛋白裂解液冰上裂解30 min，采用BCA法对各组蛋白进行定量检测。每组取25 μg蛋白，10%SDS-PAGE电泳，转膜至PVDF膜，封闭液室温封闭3 h;小鼠抗人Skp2一抗按1∶1 000稀释，小鼠抗人β-actin一抗按1∶3 000稀释，4℃摇床上孵育过夜;TBST洗膜10 min，重复3次;山羊抗小鼠二抗按1∶5 000稀释，37℃孵育2 h;TBST洗膜10 min，重复3次;最后用ECL发光试剂盒显影;BIO-RAD凝胶成像仪检测条带并进行灰度值分析，计算各组Skp2蛋白相对量。实验重复3次。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行分析，实验数据以±s表示，各处理组间差异采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法。

2 结果

图1 流式细胞术检测LY294002作用K562细胞36 h后各组细胞周期分布情况

2.1 不同浓度LY294002对K562细胞增殖抑制作用 MTT法检测各组细胞的增殖抑制率的结果表明:不同浓度LY294002对K562细胞的增殖均有抑制作用，在相同作用时间下，增殖抑制作用与LY294002浓度呈正比关系，浓度越高，抑制作用越强;在同一浓度下，LY294002作用时间越长，细胞增殖抑制率越高，表现出时间-剂量依赖性，见表2。

2.2 LY294002对细胞周期的影响 LY294002作用于K562细胞36 h后，流式细胞术检测结果表明:LY294002能显著改变G0/G1与S期细胞的比例。与对照组相比，随着LY294002浓度的升高，S期细胞比例逐渐减少，G0/G1期细胞则呈现出逐渐增加的趋势，差异有统计学意义(P＜0.05)，G2/M期细胞没有显著变化(P＞0.05)。见图1、表3。

表2 不同浓度LY294002作用不同时间后K562细胞的增殖抑制率(n=3，±s)

表2 不同浓度LY294002作用不同时间后K562细胞的增殖抑制率(n=3，±s)

与对照组(0 μmol/L LY294002)比较:*P＜0.05;与同一浓度的24 h实验组比较:#P＜0.05

?

表3 LY294002对K562细胞周期分布的影响(%，±s)

表3 LY294002对K562细胞周期分布的影响(%，±s)

与对照组(0 μmol/L LY294002)相比:*P ＜0.05;与 10 μmol/L LY294002组比较:#P＜0.05

?

2.3 LY294002对Skp2 mRNA表达的影响 RTPCR法结果显示:与对照组相比，10、20 μmol/L LY294002作用K562细胞36 h后，Skp2 mRNA的表达受影响，相对表达量分别为0.367±0.035、0.242±0.025，与对照组(0.476±0.027)相比，表达量明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图2。

图2 LY294002作用于K562细胞36 h后Skp2 mRNA的表达变化

2.4 LY294002对Skp2蛋白表达的影响 Western blot法结果表明，经LY294002作用36 h后，Skp2蛋白的表达量显著降低，10、20 μmol/L LY294002实验组Skp2蛋白相对表达量分别为0.528±0.091和0.349±0.067，与对照组(0.695±0.077)比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图3。

图3 LY294002作用于K562细胞36 h后Skp2蛋白的表达

3 讨论

白血病是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病，是最常见的血液系统恶性疾病。当前临床使用的治疗药物多数为细胞毒类药物，此类药物一般抑制细胞的DNA和蛋白质合成等基本机能，所以对正常细胞也有毒性，从而引起一系列的毒副作用等。20世纪末以来，分子靶向抗癌药物成为肿瘤治疗研究最活跃的领域之一。此类药物一般作用于肿瘤细胞的特定分子靶点，利用肿瘤细胞与正常细胞在基因、酶、信号转导等方面的异常，选择性抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等恶性生物行为，从而产生抗肿瘤作用，而对正常细胞的副作用较小。因此分子靶向抗癌药物很少产生传统化疗的毒副作用。

PI3K为一类脂激酶，主要催化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)磷酸化形成磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸(PIP3)，继而激活下游的Akt(蛋白激酶B)等促进细胞的生存、增殖、转移以及血管生成。生理状态下，Akt以低活性存在于细胞质中，当各种因素刺激时，Akt在PI3K作用下发生磷酸化而激活。PI3K/Akt信号通路诱导细胞的增殖、分化，避免细胞发生凋亡，此信号通路作为细胞生长增殖的重要转导通路，在维持细胞恶性生物学特性中起重要作用［5］。因此抑制该信号通路成为肿瘤治疗靶点之一。LY294002改造自槲皮素，是经典的PI3K抑制剂，其可以在上游非特异性地阻断 PI3K/Akt信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡［6－7］。在细胞增殖实验中发现LY294002体外作用K562细胞后，细胞增殖抑制率随着作用时间和作用浓度的增加而逐渐增强，为明确LY294002抑制白血病细胞增殖的机制，本研究选取36 h这个时间点通过细胞周期实验和检测细胞周期中重要的调节因子Skp2做进一步的探究。细胞周期调控与细胞增殖密切相关，在细胞周期调控中其增殖的速度是由G1期的长短决定的，当处于G0/G1细胞越多，S期细胞越少时细胞的增殖速度就会越低，这也是很多抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞增殖的机制之一，该研究显示在不同浓度LY294002作用下，S期细胞比例减少，G0/G1期细胞增加，即表现为细胞被阻滞于G0/G1期，且这种阻滞效应随着LY294002浓度的升高而更加明显，而G2/M期变化不大。这与李焘等［8］在脑胶质瘤 U87细胞株的研究结果相近。因此可以认为LY294002的使用产生了周期阻滞，抑制了K562细胞的增殖过程。

Skp2是细胞周期中重要的调节因子，能特异性识别磷酸化底物并介导其泛素化降解，许多细胞周期调控因子如p27、P21、cyclinE、cyclinD 和C-myc等都是Skp2依赖性泛素蛋白酶体途径底物。研究［9-11］表明，Skp2能够负调控细胞周期调节因子p27，下调的p27能够使细胞顺利通过G1-S期调控点，完成G1→S期的转变。Skp2在肿瘤细胞中异常高表达，与多种恶性肿瘤的发生和发展密切相关［12］。Skp2的表达降低能够抑制肿瘤细胞的周期转换，从而影响肿瘤细胞增殖［13］。本研究结果表明LY294002作用K562细胞36 h后Skp2 mRNA和Skp2蛋白水平随药物浓度增加而显著下降，使细胞周期不能顺利通过G1-S期的调控点，阻滞在G0/G1期，S期细胞减少。由此推测，阻断PI3K/Akt通路的抗肿瘤细胞增殖效应可能是通过下调Skp2的表达来实现的。

综上所述，LY294002能够通过抑制Skp2的表达，使K562细胞的生长周期受影响，无法顺利通过G1-S期限制点，形成G0/G1期阻滞，从而抑制K562细胞的增殖，为PI3K/Akt信号通路成为白血病治疗靶点奠定理论与实验基础。

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