SnoN蛋白及TGF-β在早期糖尿病大鼠视网膜组织中表达及意义

苟文军 方晏红 刘思源 刘灵琳 杨旭 李利文

【实验研究】

SnoN蛋白及TGF-β在早期糖尿病大鼠视网膜组织中表达及意义

苟文军 方晏红 刘思源 刘灵琳 杨旭 李利文

Accepted date：May 16，2014

From theDepartmentofOphthalmology，SuiningCentralHospital，Suining629000，SichuanProvince，China

糖尿病视网膜病变；SnoN蛋白；TGF-β

目的 观察SnoN蛋白及TGF-β在糖尿病大鼠视网膜上的表达，探讨SnoN蛋白及TGF-β与糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)的关系，为DR发病机制的研究提供新的理论依据。方法 选择健康雄性Wistar大鼠20只，随机分为正常对照组与糖尿病(DM)组，每组各10只。采用一次性腹腔注射50 mg·kg-1链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)的方法建立DM大鼠模型，正常对照组一次性给予等体积柠檬酸三钠-柠檬酸缓冲液腹腔注射。分别于造模后8周和12周处死各组大鼠，均完整摘除各组大鼠的左眼球制成眼杯，采用免疫组织化学方法检测各组大鼠视网膜上SnoN蛋白及TGF-β蛋白的表达。结果 造模后8周和12周，DM组大鼠血糖值分别为(22.64±3.57)mmol·L-1、(24.08±1.60)mmol·L-1，均明显高于正常对照组的(4.64±0.91)mmol·L-1、(4.50±0.66)mmol·L-1，差异均有显著统计学意义(均为P<0.01)。正常对照组大鼠视网膜上TGF-β无表达或弱表达，在造模后8周和12周时，DM组大鼠视网膜上TGF-β的OD值分别为0.121 0±0.005 6、0.155 0±0.007 0，均较正常对照组(0.022 0±0.007 9、0.025 0±0.007 0)明显增加(均为P<0.01)。正常对照组大鼠视网膜上SnoN蛋白高表达，在造模后8周和12周时，DM组大鼠视网膜上SnoN的OD值分别为0.412 0±0.011 3、0.214 0±0.006 9，均较正常对照组(0.945 0±0.007 0、0.944 0±0.005 1)明显降低(均为P<0.01)，且随着病程的延长，降低更明显。结论 SnoN蛋白对TGF-β信号通路起负反馈抑制作用，能降低TGF-β信号的强度和持续时间，因此对DR的防治具有重要意义。

[眼科新进展，2014，34(11)：1035-1037]

泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)是细胞内蛋白质选择性降解的重要途径。TGF-β信号通路受到转录抑制因子的调控，而SnoN蛋白是细胞核内重要的转录共抑制因子，受UPP的降解调节。因此，本实验通过观察糖尿病大鼠模型视网膜上SnoN蛋白及TGF-β的表达，探讨SnoN蛋白、TGF-β与DR之间的关系，从而为DR发病机制的研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与分组 健康雄性SPF级Wistar大鼠20只，体质量180～200 g(购自重庆腾鑫生物技术有限公司)。将Wistar大鼠适应性喂养7 d，应用随机数字表法将实验动物随机分为2组：正常对照组和DM组，每组各10只。

1.1.2 主要试剂与仪器 链脲佐菌素(streptozotocin，STZ，美国Sigma公司)；兔抗大鼠SnoN单克隆抗体、兔抗大鼠TGF-β单克隆抗体、DAB显色试剂盒(北京中杉公司)；Accu-CHEK型血糖仪及其配套血糖试纸(瑞士罗氏公司)；眼科显微剪、显微镊，前房穿刺刀(美国Alcon公司)；解剖显微镜(Leica，型号MDG29)。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病模型的建立与标本制作 临用前将STZ溶解于0.1 mmol·L-1柠檬酸三钠-柠檬酸缓冲液中(pH 4.5)，制成10 g·L-1STZ溶液。造模前将20只Wistar大鼠禁食12 h，DM组给予一次性腹腔注射50 mg·kg-1STZ，正常对照组一次性给予等体积的柠檬酸三钠-柠檬酸缓冲液(pH 4.5)腹腔注射。于造模后72 h尾静脉测血糖，空腹血糖超过16.7 mmol·L-1者为造模成功。每隔2周测一次血糖及体质量，分别于造模后8周和12周时测各组大鼠的血糖和体质量，并处死各组大鼠。完整取出大鼠的左眼球，并在解剖显微镜下制成眼杯[1]。再将眼杯置于同一瓶中，取出眼杯后依次梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋供免疫组织化学染色使用。

2 结果

2.1 各组大鼠的血糖水平比较 造模后8周和12周时，DM组大鼠血糖明显高于正常对照组，差异均有统计学意义(均为P<0.01，见表1)。

表1 2组各时间点大鼠血糖水平比较

2.2 免疫组织化学染色观察各组大鼠视网膜上TGF-β蛋白的表达 通过光学显微镜观察发现，正常对照组大鼠视网膜上TGF-β无表达或弱表达(图1A)；在造模后8周和12周时，DM组大鼠视网膜上TGF-β的表达较正常对照组明显增加，差异均有统计学意义(均为P<0.01，见图1B-图1C，见表2)。

2.3 免疫组织化学染色观察各组大鼠视网膜上SnoN蛋白的表达 通过光学显微镜观察发现，正常对照组大鼠视网膜上SnoN高表达(图2A)；在造模后8周和12周时，DM组大鼠视网膜上SnoN蛋白的表达均较正常对照组明显降低，差异均有统计学意义(均为P<0.01，见图2B-图2C，见表3)。

Figure 1 TGF-β expression in rat retina of two groups(SP，×400).A：The TGF-β was weakly expressed in rat retina of normal control group；B：At 8 weeks，the expression of TGF-β was elevated significantly in rat retina of DM group compared with normal control group；C：At 12 weeks，the expression of TGF-β was elevated significantly in rat retina of DM group compared with the time points of 8 weeks 光镜下观察各组大鼠视网膜上TGF-β的表达(SP染色，×400)。A：正常对照组大鼠视网膜上TGF-β弱表达；B：造模后8周时DM组大鼠视网膜上TGF-β的表达高于正常对照组；C：造模后12周时DM组大鼠视网膜上TGF-β的表达较8周时明显升高

表2 各组大鼠视网膜上TGF-β的OD值比较

表3 各组大鼠视网膜上SnoN的OD值比较

Figure 2 SnoN expression in rat retina of two groups(SP，×400).A：The SnoN was expressed highly in rat retina of normal control group；B：At 8weeks，the expression of SnoN was reduced significantly in rat retina of DM group compared with normal control group；C：At 12 weeks，the expression of SnoN was reduced significantly in rat retina of DM group compared with the time points of 8 weeks 光镜下观察各组大鼠视网膜上SnoN蛋白的表达(SP染色，×400)。A：正常对照组大鼠视网膜上SnoN蛋白高表达；B：造模后8周时DM组大鼠视网膜上SnoN蛋白的表达明显低于正常对照组；C：造模后12周时DM组大鼠视网膜上SnoN蛋白的表达较8周时降低

3 讨论

DR是糖尿病最严重的并发症之一，可导致失明。DR病变机制正日益受到重视[2]。已有研究表明，细胞增殖调控的失常在DR发生发展过程中也发挥着重要作用[3]。而细胞因子则贯穿于细胞生长增殖的全过程，介导一系列的炎症反应。TGF-β作为诸多细胞因子中的一种，具有调控细胞增殖与分化、凋亡及使细胞外基质(extracellular matrix，ECM)沉积的作用[4]。而糖尿病时的高血糖、糖基化终末产物和血管紧张素Ⅱ是TGF的主要刺激因子[5]。近年来的研究揭示，TGF-β信号通路受到转录激活因子(如p300、CBP)和转录抑制因子的调控，转录激活因子增强TGF-β的信号转导，促进基因的转录；而转录抑制因子则降低TGF-β的信号转导，抑制基因的转录，拮抗TGF-β的作用，因此组织中该抑制因子表达的水平在很大程度上影响TGF-β的生物学效应。

SnoN蛋白是TGF-β/Smads信号转导通路中重要的转录抑制因子[6-7]，可通过与TGF-β下游的Smad蛋白相互作用，进而调节TGF-β信号产生细胞效应。研究表明当细胞内TGF-β致Smad 2/3磷酸化，与Smad4形成复合物，SnoN蛋白就募集N-CoR蛋白、SMRT等转录共抑制因子，形成SnoN/N-CoR/SMRT复合物，使DNA上的组蛋白去乙酰化，抑制Smad信号所致的基因转录。可见，SnoN蛋白对TGF-β信号通路起负反馈抑制作用，能降低TGF-β信号的强度和持续时间，对TGF-β信号的调控起关键作用。研究表明，在真核生物中，绝大多数蛋白质通过UPP进行降解[8]，因此，SnoN蛋白表达的减少与其泛素化降解有关。而我们的前期研究结果显示，早期糖尿病大鼠视网膜上Smad7的表达降低，蛋白酶体抑制剂MG132可以使Smad7的表达增加[9]；早期糖尿病大鼠视网膜上特性泛素连接酶Smurf2表达增加，而其抑制剂MG132可下调Smurf2的表达[10]，提示DR时泛素蛋白酶体通路活化。而本实验也通过免疫组织化学观察发现，在正常对照组大鼠视网膜上TGF-β无表达或弱表达，SnoN蛋白高表达。而在造模后8周和12周时DM组大鼠视网膜上TGF-β的表达均较正常对照组明显增加(均为P<0.01)，SnoN的表达均较正常对照组明显降低(均为P<0.01)，且随着病程的延长，降低更明显。由此说明，SnoN蛋白对TGF-β信号通路起负反馈抑制作用，能降低TGF-β信号的强度和持续时间，因此对DR的防治具有重要意义。

1 吕红彬，袁援生，李燕，李俊.鼠青光眼模型视网膜神经节细胞中热休克蛋白27表达的研究[J].中华眼科杂志，2005，41(6)：533-539.

2 Kern TS.Contributions of inflammatory processes to the development of the early stages of diabetic retinopathy[J].ExpDiabetesRes，2007，2007：95103.

3 Hammes HP.Pericytes and the pathogenesis of diabetic retinopathy[J].HormMetabRes，2005，37(Suppl 1)：39-43.

4 Massagué J，Chen YG.Controlling TGF-beta signaling[J].GenesDev，2000，14(6)：627-644.

5 Reeves WB，Andreoli TE.Transforming growth factor beta contributes to progressive diabetic nephropathy[J].ProcNatlAcadSciUSA，2000，97(14)：7667-7669.

6 Sarker KP，Wilson SM，Bonni S.SnoN is a cell type-specific mediator of transforming growth factor-beta responses[J].BiolChem，2005，208(13)：13037-13046.

7 Tan R，Zhang J，Tan X，Zhang X，Yang J，Liu Y.Downregulation of SnoN expression in obstructive nephropathy is mediated by an enhanced ubiquitin-dependent degradation[J].AmSocNephrol，2006，17(10)：2781-2791.

8 Voorhees PM，Dees EC，O’Neil B，Orlowski RZ.The Proteasome as a target for Cancer Therapy[J].ClinCancerRes，2003，9(17)：6316-6325.

9 苟文军，刘思源，覃冬.泛素-蛋白酶体抑制剂MG132对糖尿病大鼠视网膜上Smad7表达的影响[J].眼科新进展，2012，32(11)：1014-1016.

10李利文，苟文军.泛素-蛋白酶体抑制剂MG132对糖尿病大鼠视网膜上Smurf2及Smad7表达的影响[J].实用医院临床杂志，2013，10(5)：60-63.

date：Feb 17，2014

Expressions of SnoN protein and TGF-β in retinas of early diabetic rats and its significance

GOU Wen-Jun，FANG Yan-Hong，LIU Si-Yuan，LIU Ling-Lin，YANG Xu，LI Li-Wen

diabetic retinopathy；SnoN protein；TGF-β

Objective To investigate the expression of SnoN and TGF-β in the retinas of diabetic rats，then study the role of the SnoN and TGF-β in diabetic retinopathy，and provide a new theoretical basis for studying DR pathogenesis.Methods Twenty male Wistar rats were randomly divided into normal control group and DM group，10 cases in each group.DM model was established by intraperitoneal injection of 50 mg·kg-1STZ.At 8 weeks and 12 weeks，the rats were sacrificed and removed left eyeballs to make the eye cups.SnoN and TGF-β protein expression in the retina were detected by immunohistochemistry.Results At 8 weeks and 12 weeks，the blood glucose in DM group were (22.64±3.57)mmol·L-1and (24.08±1.60)mmol·L-1，respectively，which were higher than those in normal control group (4.64±0.91)mmol·L-1and (4.50±0.66)mmol·L-1，there were significant differences (allP<0.01).The TGF-β was expressed weakly or was not expressed in rat retina of normal control group.At 8 weeks and 12 weeks，the value of average optical density of TGF-β were 0.121 0±0.005 6 and 0.155 0±0.007 0 in rat retina of DM group.Compared with normal control group(0.022 0±0.007 9 and 0.025 0±0.007 0)，TGF-β of rat retina expression in DM group were elevated significantly(allP<0.01).The SnoN protein was expressed highly in rat retina of normal control group.At 8 weeks and 12 weeks，the value of average optical density of SnoN were 0.412 0±0.011 3 and 0.214 0±0.006 9 in rat retina of DM group.Compared with normal control group(0.945 0±0.007 0 and 0.944 0±0.005 1)，SnoN of rat retina expression in DM group were reduced significantly(allP<0.01)，and it was reduced furtherly with the extension of time.Conclusion The SnoN protein maybe reduce the intensity and duration of TGF-β signaling with the role of negative feedback inhibition，so has the great significance for the prevention and control of DR.

苟文军，方晏红，刘思源，刘灵琳，杨旭，李利文.SnoN蛋白及TGF-β在早期糖尿病大鼠视网膜组织中表达及意义[J].眼科新进展，2014，34(11)：1035-1037.

10.13389/j.cnki.rao.2014.0286

苟文军，男，1984年1月出生，四川遂宁人，在读硕士研究生。联系电话：15983064437；E-mail：gwjlwj2008@aliyun.com

About GOU Wen-Jun：Male，born in January，1984.Postgraduate student.Tel：15983064437；E-mail：gwjlwj2008@aliyun.com

2014-02-17

629000 四川省遂宁市，遂宁市中心医院眼科

修回日期：2014-05-16

本文编辑：付中静

[Rec Adv Ophthalmol，2014，34(11)：1035-1037]