通心络胶囊对糖尿病小鼠视网膜IKKβ/IKBα/NF-κB通路的作用△

王杏 王超 邢邯英 刘敏 张哲

【实验研究】

通心络胶囊对糖尿病小鼠视网膜IKKβ/IKBα/NF-κB通路的作用△

王杏 王超 邢邯英 刘敏 张哲

Accepted date：Sep 3，2014Foundation item：Major State Basic Research Development Program of China(973 Program)(No：2012CB 518600)From theDepartmentofGerontology，HebeiGeneralHospital，Shijiazhuang050051，HebeiProvince，China

Responsible author：WANG Chao，E-mail：cwyx163@163.com

通心络胶囊；糖尿病视网膜病变；IKKβ/IKBα/NF-κB

目的 观察通心络胶囊对糖尿病小鼠视网膜IKKβ/IKBα/NF-κB通路的影响。方法 40只KK/Upj-Ay小鼠随机分为模型组、通心络低(1 g·kg-1)、中(2 g·kg-1)、高(4 g·kg-1)剂量组，每组各10只，10只C57BL/6小鼠为对照组。通心络组按相应剂量灌胃给药，对照组和模型组给予等体积的蒸馏水，每天1次，连续12周。测定体质量、空腹血糖值(fasting blood glucose，FBG)，伊文思蓝法(evans blue method，EB)测定血-视网膜屏障的通透性，HE染色法观察视网膜形态学变化，Real-time PCR(qPCR)和Western blot 法测定IKKβ、IKBα、NF-κB mRNA和蛋白的表达及P-IKBα和核NF-κB蛋白的表达。结果 通心络高剂量组较中、低剂量组细胞结构更致密，排列更有序。通心络低、中、高剂量组EB含量分别(20.82±3.88)ng·mL-1、(16.43±2.60)ng·mL-1、(16.14±2.42)ng·mL-1，较模型组(25.53±3.57)ng·mL-1明显下降(均为P<0.05)。通心络中、高剂量组IKKβ mRNA和蛋白表达量较模型组显著下降(均为P<0.01)；通心络组IKBα mRNA，通心络中、高剂量组IKBα蛋白以及P-IKBα蛋白的表达均较模型组显著下降(均为P<0.01)，通心络低、中、高剂量组核NF-κB蛋白表达量为0.52±0.05、0.43±0.05、0.34±0.04，显著低于模型组(0.61±0.07)(均为P<0.05)。结论 通心络胶囊可明显改善KK/Upj-Ay小鼠视网膜病变，其机制与抑制IKKβ/IKBα/NF-κB通路相关。

[眼科新进展，2014，34(11)：1005-1008]

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病的严重并发症之一，近年来随着生活水平的提高，发病率和致盲率呈上升趋势。然而，对于该病的治疗却没有一种理想的药物。DR的发病机制尚不明确，有研究表明核转录因子(nuclear transcription factor，NF-κB)活化影响着该病的进程。通心络胶囊为中药复方制剂，主要成分为人参、全蝎、水蛭、蝉蜕、土鳖虫、赤芍、冰片等，已有研究将通心络胶囊用于DR的辅助治疗[1]，但其相关机制尚不清楚。本实验采用自发性2型糖尿病 KK/Upj-Ay小鼠模型，观察通心络胶囊低、中、高剂量对DR的治疗作用，并从NF-κB的激活角度探讨该药物可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 40只KK/Upj-Ay小鼠，体质量30～40 g；10只C57BL/6小鼠，体质量25～30 g；均为SPF级，雄性，12周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK-(京)2009-0002。

1.1.2 试剂与仪器 通心络胶囊(购自石家庄以岭药业股份有限公司)，IKKβ、IKBα、P-IKBα、NF-κB一抗(购自英国Abcam公司)，7300荧光定量PCR仪(购自美国ABI公司)，凝胶成像分析仪(购自美国Biorad公司)。

IKKβ引物：上游：5’-CGTGACGGAGGATGAGAGT-3’，下游：5’-CGTTTGTCTTGCTGTCTGAGA-3’，产物片段 155 bp；IKBα引物：上游：5’-GGTGTTTGAATGTATTGCTGG-3’，下游：5’-AGGCTGTTTGGCTGAGGT-3’，产物片段 155 bp；NF-κB引物：上游：5’-GCGAGAGAAGCACAGATACCA -3’，下游：5’-GGTCAGCCTCATAGTAGCCAT-3’，产物片段168 bp；GAPDH引物：上游：5’-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3’，下游：5’-TGCTGAGTATGTCG TGGAGTC-3’，产物片段143 bp(上海生工合成)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与给药 40只KK/Upj-Ay小鼠按血糖值随机分为模型组(Model)、通心络低(TXL-L，1 g·kg-1)、中(TXL-M，2 g·kg-1)、高(TXL-H，4 g·kg-1)剂量组，C57BL/6小鼠为对照组(NC)。每组各10只，通心络高、中、低剂量组按对应剂量灌胃给药，对照组和模型组给予等体积的蒸馏水，均为每天1次，连续12周。4、8、12周后记录动物体质量。

1.2.2 空腹血糖值测定 实验结束后，禁食12 h，眼球取血，血糖仪测定各组小鼠空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)值。

1.2.3 血-视网膜屏障的测定 给药结束后，每组随机取6只小鼠，尾静脉注射伊文思蓝(evans blue method，EB)溶液，按照文献方法，测定EB在视网膜的含量[2]。

1.2.4 形态学变化 冰上常规分离视网膜组织，将小鼠视网膜组织置于20倍体积的40 g·L-1多聚甲醛溶液中固定，从低浓度到高浓度梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片，切片厚度0.4 μm。依照以下顺序脱蜡至水：二甲苯2次、无水乙醇2次、每次10 min；体积分数95%、90%、80%、70%乙醇，每次5 min，蒸馏水5 min；常规HE染色。光学显微镜下观察形态学变化。

1.2.5 IKKβ、IKBα、NF-κB mRNA表达量的测定 分离小鼠眼球视网膜组织，Trizol法提取RNA，按照反转录试剂盒说明反转录为cDNA，-20 ℃保存。Real-Time PCR(qPCR)方法扩增，95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。以GAPDH作为内参照。最终结果计为与对照组进行比较后的相对值，对照组设置为1。

1.2.6 IKKβ、IKBα、P-IKBα、NF-κB、核NF-κB蛋白表达量的测定 取视网膜组织，加入组织裂解液，提取总蛋白或核蛋白。以β-actin作为内参照，SDS-聚丙烯凝胶电泳，待溴酚蓝距分离胶底部1 cm时，停止电泳。依目的蛋白分子量分离条带，滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸依次放置于夹板内，4 ℃、100 V电泳转膜1 h。4 ℃封闭液振荡4 h，滴加一抗，振荡混匀，4 ℃过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h。化学发光法显色，对条带进行吸光度积分扫描。用目的蛋白吸光度值/内参照吸光度值的比值进行比较。

2 结果

2.1 各组小鼠体质量及FBG的变化 各时间点各组间比较差异均有统计学意义(均为P=0.00，见表1-表2)，给药组、模型组体质量、FBG明显高于同期对照组(均为P<0.01)，模型组与给药组差异无统计学意义(均为P>0.05)。

表1 各组小鼠体质量变化情况

Group0week4weeks8weeks12weeksNC25.15±1.0227.58±1.0328.75±2.4530.48±2.75Model34.36±1.96*40.30±1.49*44.89±2.15*46.03±2.17*TXL-L35.04±2.0539.01±2.3943.47±3.2344.44±3.38TXL-M34.83±2.9838.80±2.7643.28±2.1844.30±2.04TXL-H34.92±1.8638.36±2.6042.47±3.6543.45±3.75F43.4646.5455.4548.91P0.000.000.000.00

Note：Compared with NC group，*P<0.01

2.2 EB含量的变化 与对照组比较，模型组EB含量明显升高(P<0.01)，通心络组EB含量较模型组明显下降(均为P<0.05)。通心络中、高剂量组间无统计学差异(P>0.05)，与低剂量组间均有统计学差异(均为P<0.05，见表3)。

表2 各组小鼠FBG变化情况

Table 2 Effects of TXL on FBG of each group

Group0week12weeksNC5.33±0.815.51±0.88Model14.83±2.66*17.54±2.79*TXL-L14.72±2.7816.46±2.44TXL-M14.64±2.6115.84±1.86TXL-H14.86±2.3114.97±2.27F32.4551.60P0.000.00

Note：Compared with NC group，*P<0.01

表3 通心络胶囊对各组小鼠EB含量的影响

Table 3 Effects of TXL on EB of each group

GroupEBNC12.62±2.55Model25.53±3.57**TXL-L20.82±3.88*TXL-M16.43±2.60*TXL-H16.14±2.42*F15.67P0.00

Note：Compared with NC group，*P<0.05，**P<0.01

2.3 形态学观察 HE染色显示对照组视网膜各层细胞层次分明，结构清晰；模型组视网膜色素上皮层明显变薄，细胞排列紊乱；通心络各剂量组细胞排列较清晰，剂量高组结构更致密，细胞排列更有序，上皮层细胞较模型组增厚明显(图1)。

2.4 视网膜IKKβ、IKBα、NF-κB mRNA和蛋白以及核NF-κB蛋白、P-IKBα蛋白表达的变化 模型组IKKβ、IKBα mRNA和蛋白表达明显高于对照组(均为P<0.01)，模型组核NF-κB和P-IKBα蛋白表达明显高于对照组(均为P<0.01)；与模型组比较，通心络中、高剂量组IKKβ mRNA和蛋白表达显著下降(均为P<0.01)，各剂量组间有统计学差异(P<0.01)；通心络组IKBα mRNA表达均显著低于模型组(均为P<0.01)，低剂量组与中、高剂量组间均有统计学差异(均为P<0.01)，中、高剂量组间无统计学差异(P>0.05)；通心络中、高剂量组IKBα蛋白、P-IKBα蛋白的表达较模型组显著下降(均为P<0.01)，通心络各剂量组之间有统计学差异(P<0.05)；通心络组核NF-κB蛋白表达均低于模型组(均为P<0.05)，各剂量组间有统计学差异(P<0.05)；总NF-κB mRNA和蛋白表达在各组间无统计学差异(均为P>0.05，见表4)。

Figure 1 Changes of retinal morphology.A：NC group；B：Model group；C：TXL-L group；D：TXL-M group；E：TXL-H group 各组视网膜组织的形态学变化(HE，×200)。A：对照组视网膜；B：模型组视网膜；C：通心络低剂量组视网膜；D：通心络中剂量组视网膜；E：通心络高剂量组视网膜

表4 通心络对各组小鼠视网膜IKKβ、IKBα、NF-κB mRNA及蛋白表达的影响

Note：Compared with NC group，*P<0.01；Compared with model group，△P<0.05，#P<0.01

3 讨论

本研究采用了自发性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠作为研究DR的模型[3]，通心络胶囊灌胃12周，各剂量组不同程度地降低了视网膜内EB含量，改善其病理损伤，使视网膜各层较模型组排列整齐，从形态学上证实了通心络胶囊可延缓糖尿病小鼠DR的出现，对DR的防治有一定作用。通心络各剂量组与模型组相比，通心络组体质量和FBG无统计学差异(均为P>0.05)，故考虑通心络胶囊不是通过降低体质量和血糖来改善DR的。各组间比较有统计学差异(均为P=0.00)，说明不同剂量对视网膜的影响是不同的。

目前，DR的发病机制仍不确切，越来越多的证据显示DR是一种炎性反应[4]。NF-κB为重要的核转录因子之一，通常与IKB形成复合体，以无活性形式存在于细胞质中，可被多种因素激活，进入细胞核，与基因上的相应序列结合，调控炎性因子的表达，如TNF-α、白细胞介素(interleukin，IL)系列、急性期反应蛋白等[5]。很多研究表明，NF-κB均积极参与糖尿病及其并发症的发生[6-7]，故本研究围绕此展开。NF-κB信号通路中3个关键因子依次为IKKβ、IKBα和NF-κB[8]。当高糖、缺氧、氧化应激[9]、病毒、细菌等因素刺激细胞时，可激活IKKs，本实验也观察到模型组IKKβ较对照组有明显的上升趋势，IKKβ催化IKBα的N-末端丝氨酸磷酸化，实验中显示磷酸化的P-IKBα增加明显，导致IKBα泛素化并降解，则NF-κB游离，向细胞核内转移，核内的NF-κB增多，启动了炎症反应和下游通路。IKKs主要包括IKKα、IKKβ和 IKKγ，p50/p65 二聚体可被IKKβ活化，RelB/p52 二聚体可被IKK-α活化，IKKα、IKKβ的活化可被IKKγ调节。NF-κB通常指P50/P65(ReLA)的二聚体。因此，本研究对NF-κB信号通路中的IKKβ、IKBα磷酸化和NF-κB的核表达环节进行了检测，显示模型组IKKβ、IKBα mRNA和蛋白，以及核NF-κB和P-IKBα蛋白表达均升高，给予不同剂量通心络胶囊治疗后，能不同程度降低以上因子的表达。提示通心络胶囊能通过抑制DR小鼠视网膜IKKβ、IKBα的磷酸化和核NF-κB的活化，干预IKKβ/IKBα/NF-κB信号通路，从而起到改善并防治DR的作用。

NF-κB的活化可引起血管内皮生长因子(VEGF)、细胞间黏附因子(ICAM-1)等异常增多[10]。目前，VEGF是最强的促进血管生长的因子[11]，正常状态下，视网膜色素上皮细胞、Müller 细胞少量分泌VEGF，保持视网膜正常及血管的稳定；VEGF异常增多时，将引起内皮细胞增殖和迁移，增加血管通透性，参与新生血管形成[12]。ICAM-1的表达增多，破坏血-视网膜屏障[13]，本研究中也观察到模型组EB含量增多，通心络组EB含量随浓度增长而下降。通心络胶囊可能通过降低NF-κB的表达，减少VEGF、ICAM-1的表达，抑制新生血管的形成和血-视网膜屏障的通透性，延缓DR的发生，具体机制还需进一步研究。

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date：Aug 9，2014

Effects of Tongxinluo capsule on retina through IKKβ/IKBα/NF-κB pathway in diabetic mouse

WANG Xing，WANG Chao，XING Han-Ying，LIU Min，ZHANG Zhe

Tongxinluo capsule；diabetic retinopathy；IKKβ/IKBα/NF-κB

Objective To investigate the effects of Tongxinluo(TXL) capsule on IKKβ / IKBα / NF-κB pathway of retina in diabetic mouse.Methods Forty KK/Upj-Ay mice were randomly divided into model group，TXL low-dose group(TXL-L，1 g·kg-1)，medium group(TXL-M，2 g·kg-1)，high group(TXL-H，4 g·kg-1)，10 cases in each group，and another 10 C57BL/6 mice were selected in the control group.The TXL groups were given drug with corresponding dose by oral administration，meanwhile control group and model group were given distilled water of equal volume，once a day in the ensuing 12 weeks.Body weight and fasting blood glucose were detected，and blood-retinal barrier permeability were determined by evans blue(EB) method.The morphological changes of retinal were observed by HE staining.The expression levels of IKKβ，IKBα，NF-κB mRNA and protein,P-IKBα and nuclear NF-κB protein,in retina were measured by real-time PCR and Western Blot.Results The cells of the retina in TXL-H group were arranged more compact and more orderly than TXL-L and TXL-M groups.The EB content in TXL groups were(20.82±3.88)ng·mL-1，(16.43±2.60)ng·mL-1and(16.14±2.42)ng·mL-1，respectively，which were lower significantly than that in the model group(25.53±3.57)ng·mL-1(allP<0.05).Compared with the model group，the mRNA and protein levels of nucleur IKKβ were reduced obviously in TXL-M and TXL-H group(allP<0.01)，and the protein levels of IKBα and P-IKBα were decreased in the TXL-M and TXL-H group(allP<0.01).The expression levels of NF-κB protein in TXL groups were 0.52±0.05，0.43±0.05，0.34±0.04，respectively，which were lower than the model group(0.61±0.07)(allP<0.05).Conclusion TXL capsule can significantly improve KK / Upj-Ay mice diabetic retinopathy and the mechanism is related with inhibition of IKKβ / IKBα/NF-κB pathway.

王杏，王超，邢邯英，刘敏，张哲.通心络胶囊对糖尿病小鼠视网膜IKKβ/IKBα/NF-κB通路的作用[J]. 眼科新进展，2014，34(11)：1005-1008.

10.13389/j.cnki.rao.2014.0279

王杏，女，1986年9月出生，硕士。联系电话：0311-85988007；E-mail：wangxingvet@163.com

About WANG Xing：Female，born in September，1986.Master degree.Tel：+86-311-85988007；E-mail：wangxingvet@163.com

2014-08-09

国家重点基础研究发展计划项目(973计划)(编号：2012CB518600)

050051 河北省石家庄市，河北省人民医院老年医学重点实验室

王超，E-mail：cwyx163@163.com

修回日期：2014-09-03

本文编辑：付中静

[Rec Adv Ophthalmol，2014，34(11)：1005-1008]