AG490防治后发性白内障的实验研究

郭莹 韩瑶 魏树瑾 冯晶晶

【实验研究】

AG490防治后发性白内障的实验研究

郭莹 韩瑶 魏树瑾 冯晶晶

Accepted date：Jun 15，2014

From theDepartmentofOphthalmology，theFirstHospitalofQinhuangdao(GUO Ying)，Qinhuangdao066000，HebeiProvince，China；DepartmentofOphthalmology，theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity(HAN Yao)，Shijiazhuang050000，HebeiProvince，China；DepartmentofOphthalmology，TianjinNankaiHospital(WEI Shu-Jin)，Tianjin300100，China；DepartmentofOphthalmology，BeijingHaidianMaternalandChildHospital(FENG Jing-Jing)，Beijing100000，China

Responsible author：HAN Yao，E-mail：hanyao988@126.com

后发性白内障；晶状体上皮细胞；BrdU；AG490；兔

目的 通过在活体兔眼行白内障超声乳化术制造兔眼后发性白内障模型，并与正常兔和应用AG490的兔进行对照，研究AG490对后发性白内障的作用，并观察术后不同时间AG490对兔眼的影响及此药的毒副作用。方法 将35只(70眼)成年健康新西兰大白兔随机分为3组：对照组：于前房内注入BrdU(0.02 mL)；模型组：行透明晶状体超声乳化术，术中前房内注入BrdU(0.02 mL)+透明质酸钠(0.05 mL)+生理盐水(0.10 mL)；治疗组：行透明晶状体超声乳化术，术中前房内注入BrdU(0.02 mL)+透明质酸钠(0.05 mL)+AG490(0.10 mL)，术后1 d、3 d、7 d、1个月、2个月对3组兔眼进行裂隙灯显微镜、视网膜电图(electroretinogram，ERG)及病理组织学检查，免疫组织化学方法检测晶状体后囊膜上BrdU的表达。结果 术后各时间点模型组与治疗组前房炎症反应情况及ERG检查差异均无统计学意义(均为P>0.05)。治疗组后囊膜混浊发生率低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)。各时间点治疗组赤道部及后囊膜晶状体上皮细胞均较模型组少。各时间点3组BrdU的表达差异均有统计学意义(均为P<0.01)。术后1 d、3 d、7 d模型组与对照组及治疗组赤道部及前囊下阳性细胞核标记指数值比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)，对照组与治疗组比较差异无统计学意义(均为P>0.05)；术后1个月、2个月各组间赤道部及前囊下阳性细胞核标记指数值两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 AG490可以通过抑制晶状体上皮细胞增殖而有效地延缓后发性白内障的发生。在2个月内的不同时间点AG490对兔眼均无明显的毒副作用。

[眼科新进展，2014，34(11)：1025-1029]

后发性白内障是指白内障摘出术后，或外伤性白内障部分皮质吸收后所形成的晶状体后囊膜混浊。后发性白内障是目前白内障手术后最主要的并发症，成人术后3～5 a发生率达30%～50%[1-2]，儿童术后2 a内几乎全部发生后发性白内障[3]，明显影响视力。溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine，BrdU)是DNA前体胸腺嘧啶核苷的类似物，在细胞增殖过程中，可与内源性胸腺嘧啶核苷竞争掺入S期(即DNA合成期)细胞的单链DNA核苷酸序列中[4]，不随细胞分裂而减少，是80年代中期以来最受重视的非放射性标记物之一。AG490[5]是一种人工合成的苯亚甲基丙二腈的脂类衍生物，结构类似酪氨酸，可以和受体酪氨酸激酶竞争结合位点，可以阻断JAK激酶激活，从而阻断JAK/STAT信号转导，抑制增殖。

本实验通过在活体兔眼行白内障超声乳化术制造兔眼后发性白内障模型，并与正常组和应用AG490组进行对照，研究患后发性白内障的兔眼后囊膜中BrdU水平是否比正常兔眼高以及AG490是否可以减缓或抑制后发性白内障的发生，为进一步研究后发性白内障的发生机制及临床用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂 BrdU、胰蛋白酶、Tyrphostin AG490(美国Sigma公司)，抗BrdU抗体(天津金脉公司)，DAB显色剂、PV-9000试剂盒(北京中山生物技术有限公司)，APES黏片剂、赖氨酸黏片剂(博士德试剂公司)，速眠新Ⅱ注射液(长春军需大学兽医研究所)，透明质酸钠(上海建华生物有限公司)。AG490(0.2 g·L-1)：取0.25 mL二甲基亚砜(DMSO)将5 mg AG490溶解，再加入双蒸水配成所需浓度，现用现配。

1.2 动物及分组 成年健康新西兰大白兔(河北医科大学动物中心提供)35只(70眼)，体质量2.5～3.0 kg，雌雄兼用，常规眼科检查，排除内外眼疾病。随机分为3组：对照组10只(20眼)，于前房内注入BrdU(0.02 mL)，分别于1 d、3 d、7 d、1个月、2个月摘取眼球，每组各取2只(4眼)。模型组25只(25眼，均为左眼)，行透明晶状体超声乳化术，术中前房内注入BrdU(0.02 mL)+透明质酸钠(0.05 mL)+生理盐水(0.10 mL)，按术后1 d、3 d、7 d、1个月、2个月分5组，每组各5只5眼。治疗组25只(25眼，均为右眼)，行透明晶状体超声乳化术，术中前房内注入BrdU(0.02 mL)+透明质酸钠(0.05 mL)+AG490(0.10 mL)，按术后1 d、3 d、7 d、1个月、2个月分5组，每组各5只5眼。

1.3 方法

1.3.1 晶状体后囊膜混浊情况观察 复方托品酰胺充分散瞳，裂隙灯下观察并记录每只大白兔晶状体混浊情况。参照Kruger等[6]对后发性白内障评价方法，即0～3分法：0分：后囊无混浊；1分：后囊轻度混浊，眼底能看清；2分：后囊中度混浊，眼底部分模糊不清；3分：后囊明显混浊，眼底不能窥见或周边部环状皮质增生。

1.3.2 药物毒性观察 术后裂隙灯下观察有无角膜水肿、混浊，光镜下HE染色观察有无内皮损伤，结膜有无充血。前房反应：房水混浊分级[7]：0级：房水清晰透明，Tyndall现象(-)；1级：房水Tyndall现象(+)，较少或无纤维素性渗出，窄裂隙1个视野内可见1～10个光点；2级：房水Tyndall现象(++)，明显纤维素性渗出，窄裂隙1个视野内可见 11～30个光点；3级：房水明显混浊伴大量纤维素性渗出或前房积脓。通过视网膜电图(electroretinogram，ERG)检查及光镜下视网膜组织观察了解药物有无视网膜毒性。ERG检查主要观察b波振幅是否降低或消失。

1.3.3 病理组织学观察 按分组要求与不同时间点，在麻醉状态下，迅速摘除眼球，立即置于福尔马林-醋酸-酒精固定液中固定48 h后，剪开角膜，去除虹膜，取出术后晶状体残留部分(后囊膜及部分前囊膜)，冲洗后梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片。常规HE染色后光镜下观察后囊膜组织的病理变化。

1.3.4 免疫组织化学方法检测BrdU的表达 采用SP法进行免疫组织化学染色，每次染色均设阴性对照，用PBS代替一抗。在光学显微镜下观察，细胞核呈棕黄色或黄色者为BrdU表达阳性。应用高倍镜下细胞核计数对BrdU表达进行定量分析。结果判定：对阳性细胞核进行计数，计算阳性细胞核标记指数(LI)=BrdU阳性细胞数/观察细胞总数×100%。计数前囊下上皮细胞数时，每张切片随机选取3个高倍视野，求其平均值作为该标本前囊下部LI值；计数赤道部细胞时，每张切片选2个高倍视野，取其平均值作为该标本赤道部LI值。

2 结果

2.1 一般观察 术后各时间点模型组与治疗组前房炎症反应情况差异无统计学意义(χ2=0.397，P=0.529，见表1)，两组与对照组比较差异均无统计学意义(均为P>0.05)。术后ERG变化：各时间点模型组与治疗组相比b波振幅差异均无统计学意义(均为P>0.05，见表2-表3)，对照组暗适应ERG b波振幅、ERG最大反应b波振幅分别为(167.40±22.57)μV、(154.50±24.12)μV，与其他两组比较差异均无统计学意义(均为P>0.05)。晶状体后囊膜混浊情况：整个实验过程中，对照组晶状体后囊膜未发生混浊，与模型组后囊膜混浊发生率比较差异有统计学意义(P<0.01)，与治疗组比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗组后囊膜混浊发生率低于模型组，差异有显著统计学意义(P<0.01，见表4)。

表1 超声乳化术后1 d兔眼前房炎症反应情况

Table 1 Inflammatory reaction in anterior chamber of rabbit eyes at postoperative 1 day

GroupnLevel1Level2Model25196Treatment25178

表2 各组暗适应ERG b波振幅

表3 各组ERG最大反应b波振幅

TimeModelgroupTreatmentgroupFPtP(ttestort’test)1day150.60±35.50168.00±35.480.070.80-0.780.463days166.00±8.80183.40±26.172.560.15-1.410.207days169.00±7.21173.60±30.0616.370.00-0.330.751month144.40±15.37144.60±29.365.730.04-0.130.992months159.80±29.15157.60±12.623.510.100.160.88

表4 术后1个月和2个月兔眼后囊膜混浊情况

Table 4 Posterior capsular opacification of rabbit eyes at postoperative 1 month and 2 months

Group1month2monthsPosteriorcapsularopacification01month2months11month2months21month2monthsP1month2monthsModel1052081040.0050.002Treat-ment105941100<0.01<0.01

2.2 晶状体病理组织学改变 对照组晶状体前囊下上皮细胞核圆，赤道部为单层细胞，后囊膜无细胞。模型组术后1 d、3 d，晶状体赤道部上皮细胞多层化，后囊可见移行的细胞；术后7 d，赤道部复层上皮细胞形成向后囊扩展的细胞集落，后囊膜可见成簇的上皮细胞；术后1个月，前后囊黏附部位有纺锤形细胞增殖，在此细胞与上皮细胞间可见不均匀的与晶状体囊同样着色的膜样组织；术后2个月，后囊出现梭形纤维细胞及纤维组织(图1-图2)。治疗组术后1 d、3 d晶状体前囊下及赤道部均为单层上皮细胞，残留细胞明显变性，细胞间无明显联系，胞膜不完整，后囊膜无细胞；术后7 d，赤道部上皮细胞 2～3层，后囊膜未见移行的细胞；术后1个月，晶状体赤道部上皮细胞多层化，后囊膜可见少量移行的细胞，但明显较对照组少；术后2个月，赤道部上皮细胞多层化，后囊膜可见少量移行的细胞，未见梭形纤维细胞及纤维组织(图3-图4)。

2.3 晶状体中BrdU的表达 光学显微镜下，细胞核呈黄色或棕黄色者为BrdU的阳性表达。对照组赤道部及前囊下有少量BrdU表达。模型组术后1 d、3 d，赤道部及前囊下晶状体上皮细胞BrdU表达明显增强且达峰值，镜下可见大量棕黄色细胞核，后囊可见少量BrdU表达；术后7 d，后囊可见大量BrdU表达，赤道部及前囊下仍有BrdU表达，细胞核颜色深浅不一，且较前减少；术后1个月、2个月，BrdU仅在赤道部与前后囊黏附部位有少量表达，2个月时后囊已纤维化(图5-图6)。治疗组术后1 d、3 d，赤道部及前囊下部可见棕黄色细胞核，但较模型组少，后囊未见BrdU阳性表达；术后7 d，赤道部及前囊下仍可见棕黄色细胞核，后囊未见BrdU阳性表达；术后1个月、2个月，赤道部及前囊下棕黄色细胞核较前减少，后囊可见少量BrdU表达(图7-图8)。3组各时间点BrdU表达差异均有统计学意义(均为P<0.01，见表5-表6)。术后1 d、3 d、7 d模型组与对照组及治疗组赤道部及前囊下LI值比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)，对照组与治疗组比较差异无统计学意义(均为P>0.05)；术后1个月、2个月各组间赤道部及前囊下LI值两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

Figure 1 Posterior capsule of rabbit in model group at postoperative 7 days(HE，×200).Figure 2 Posterior capsule of rabbit in model group at postoperative 2 months(HE，×400).Figure 3 Posterior capsule of rabbit in treatment group at postoperative 7 days(HE，×200).Figure 4 Posterior capsule of rabbit of treatment group at postoperative 2 months(HE，×400) 图1 术后7 d模型组晶状体后囊(HE，×200)。图2 术后2个月模型组晶状体后囊(HE，×400)。图3 术后7 d治疗组晶状体后囊(HE，×200)。图4 术后2个月治疗组晶状体后囊(HE，×400)

Figure 5 Expression of BrdU in posterior capsule of model group at postoperative 7 days(Immunohistochemical staining，×400).Figure 6 Expression of BrdU in sticking position between anterior capsule and posterior capsule in model group at postoperative 2 months(Immunohistochemical staining，×200).Figure 7 Expression of BrdU in posterior capsule of treatment group at postoperative 7 dayS(Immunohistochemical staining，×400).Figure 8 Expression of BrdU in sticking position between anterior capsule and posterior capsule of treatment group at postoperative 2 months(Immunohistochemical staining，×200) 图5 术后7 d模型组晶状体后囊BrdU的表达(免疫组织化学染色，×400)。图6 术后2个月模型组晶状体前囊与后囊黏附部位BrdU的表达(免疫组织化学染色，×200)。图7 术后7 d治疗组晶状体后囊BrdU的表达(免疫组织化学染色，×400)。图8 术后2个月治疗组晶状体前囊与后囊黏附部位BrdU的表达(免疫组织化学染色，×200)

表5 各组晶状体前囊下LI值比较

表6 各组间晶状体赤道部LI比较

3 讨论

后发性白内障是晶状体摘除术后，以晶状体上皮细胞为中心的一系列增殖性变化，它是一个逐渐变化的过程，我们利用兔眼模型对后发性白内障的形成过程追踪观察，对其病理改变及细胞增殖情况进行研究。

近年来国内外学者不断从手术技术的改进及抗增殖药物的应用等方面预防后发性白内障的发生，但手术仍不能完全避免晶状体上皮细胞的残留，体外实验或体内应用抗代谢药物有可能在临床上预防后发性白内障的发生，但目前已研究过的药物均毒性较大或价格较贵，不适合在临床应用。本研究中将一种新药AG490注入晶状体超声乳化术后兔眼的囊袋内，观察此药对兔眼后囊膜混浊形成的影响，并观察该药对角膜、结膜、前房及眼内的毒性作用。

3.1 后发性白内障兔眼晶状体BrdU的表达 BrdU是一种非放射性标记物，且敏感性高，目前已用于许多领域。本实验采用阳性细胞核计数的方法来反映晶状体上皮细胞增殖情况。我们在实验中观察到，对照组有少许晶状体上皮细胞BrdU阳性表达。模型组术后1 d及3 d赤道及前囊下晶状体上皮细胞BrdU表达明显增强且达峰值，与对照组相比差异显著(P<0.05)，说明此时残留的晶状体上皮细胞已大量进入增殖期。此后BrdU表达逐渐减弱，术后7 d，赤道部复层细胞中仍有BrdU阳性表达，上皮细胞分化为晶状体纤维后BrdU阳性表达消失。术后1～2个月，赤道部及前囊下部晶状体上皮细胞的LI值进一步下降，2个月后后囊纤维化。各时期晶状体前囊下细胞LI值始终小于赤道部，证明赤道部细胞的增殖能力明显强于前囊下部，这与生理状态相一致，也说明晶状体摘除术后，赤道部晶状体上皮细胞增殖起主导作用。

3.2 AG490对后发性白内障的延缓作用及其毒性 预防后发性白内障的理想药物应具备以下3个条件[8-9]：能够有效抵制晶状体上皮细胞增生；该药物对眼内组织不会产生明显的毒副作用；临床用药方便、安全易行、价格不能太高。

AG490是酪氨酸激酶抑制剂，可以通过阻断JAK激酶激活，从而阻断JAK/STAT信号转导，抑制增殖。Ebong等[10]研究发现：JAK/STAT3途径被胰岛素样生长因子1和血小板衍性生长因子激活后stat3磷酸化成磷酸化stat3，可导致晶状体上皮细胞的增殖，过量的stat3被激活可导致白内障的发生。AG490可以使stat3信号转导通路成员活性与表达下降，进而抑制stat3通路活化。在本实验中，我们通过免疫组织化学染色观察到用药眼比未用药眼BrdU表达明显减弱，说明用药眼晶状体上皮细胞增殖较未用药眼少，因此，我们可以认为AG490通过阻断JAK/STAT途径的信号转导抑制晶状体上皮细胞的增殖，从而能够预防后发性白内障的发生。

目前国内外尚无关于AG490毒性方面的报道，因此我们重点观察了此药对兔眼是否有毒性作用。临床观察表明AG490用于兔眼内术后反应轻。观察视觉电生理的变化是评价眼部药物毒性的重要指标，因此我们对正常眼、术后未用AG490眼与用AG490眼分别进行了暗视ERG检查，结果显示手术前后b波的变化不明显，用药与未用药眼b波差异也无显著性。可以认为AG490对兔眼术后2个月内的ERG无明显影响，是否有一过性的改变需进一步研究。

综上所述，晶状体超声乳化术后晶状体上皮细胞增殖可引起后发性白内障，我们可以通过BrdU表达情况观察后发性白内障严重程度。AG490能够抑制晶状体上皮细胞增殖，从而延缓后发性白内障的发生，且2个月内无毒副作用。目前此药尚处于动物实验阶段，对此药及其缓释剂的进一步研究对后发性白内障及其他临床学科疾病的防治均有十分重要的意义。

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date：Feb 18，2014

Experimental study on prevention of after-cataract by AG490

GUO Ying，HAN Yao，WEI Shu-Jin，FENG Jing-Jing

after-cataract；lens epithelial cell；BrdU；AG490；rabbit

Objective To make the model of after-cataract by phacoemulsification，and observe the effects of AG490 on the eyes of rabbits in different time after operation and the toxicity of the drug.Methods Thirty-five big healthy white New Zealand rabbits(70 eyes) were randomly divided into three groups：(1) Normal control group：BrdU(0.02 mL) was injected into the anterior chamber；(2) Model group：They were disposed by phacoemulsification.The mixture of BrdU(0.02 mL)，sodium hyaluronate(0.05 mL) and normal saline(0.10 mL) were injected into the anterior chamber；(3) Treatment group：They were treated with phacoemulsification.The blend of BrdU(0.2 mL)，Sodium Hyaluronate(0.05 mL) and AG490(0.10 mL) were injected into the anterior chamber.The rabbit eyes of 3 groups were examined by slit-lamp microscope，ERG and pathohistology at 1 day，3 days，7 days，1 month and 2 months after operation.And the expression of BrdU on the lens capsule was detected.Results No remarkable difference was found between model group and treatment group in corneal hydrops，conjunctival congestion，inflammatory reaction of anterior chamber and ERG examination(allP>0.05).The incidence of posterior capsular opacity in treatment group was lower than that in model group(P<0.01).LEC in ambitus and posterior capsule of treatment group was much less than that of model group at different time after operation.Significant differences of the expression of BrdU were found among the three groups at different time after operation(allP<0.01).There were statistical differences in LI value in ambitus and posterior capsule at postoperative 1 day，3 days and 7 days between model group and normal control group(allP<0.05)，no difference was found between treatment group and normal control group(allP>0.05)，and statistical differences were found postoperative 1 month and 2 months between each two groups(allP<0.05).Conclusion AG490 can delay the formation of after-cataract through inhibiting proliferation of LEC effectively under the present experiment condition.No obvious poisonous and side effect of AG490 is found on the rabbit eyes at different time within 2 months.

郭莹，韩瑶，魏树瑾，冯晶晶.AG490防治后发性白内障的实验研究[J].眼科新进展，2014，34(11)：1025-1029.

10.13389/j.cnki.rao.2014.0284

郭莹，女，1979年10月出生，河北东光人，硕士，主治医师。联系电话：0335-5908207(O)；E-mail：18603385691@wo.com.cn

About GUO Ying：Female，born in October，1979.Master degree.Tel：+86-335-5908207(O)；E-mail：18603385691@wo.com.cn

2014-02-18

066000 河北省秦皇岛市，秦皇岛市第一医院眼科(郭莹)；050000 河北省石家庄市，河北医科大学第二附属医院眼科(韩瑶)；300100 天津市，天津市南开医院眼科(魏树瑾)；100000 北京市，北京市海淀区妇幼医院眼科(冯晶晶)

韩瑶，E-mail：hanyao988@126.com

修回日期：2014-06-15

本文编辑：付中静

[Rec Adv Ophthalmol，2014，34(11)：1025-1029]