高效液相色谱法测定小儿腹泻凝胶膏中吴茱萸碱及吴茱萸次碱含量

秦海军，张 毅，马 玲，陈师农，任燕茹

(1. 安徽省药物研究所，安徽 合肥 230022; 2. 安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽 合肥 230022;3. 安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230032)

小儿腹泻凝胶膏是民间治疗小儿腹泻的有效验方，由吴茱萸、肉桂、苍术、黄连、丁香等7 味中药组方，有健脾益肾、去湿止泻的功效，用于治疗小儿腹泻(脾肾阳虚证)所致大便稀溏、完谷不化、形体消瘦、面目虚浮、四肢欠温、舌苔白腻、脉细无力。方中吴茱萸温中止呕、助阳止泻、温散脾寒，肉桂补火助阳、引火归源，二药合用健脾温中，以治其本，共为君药;苍术燥湿健脾，厚朴导滞化湿，炮姜温中散寒，三药共为臣药，为增强君药之温中散寒的功效，其余均为佐药。本方配伍以健脾温中、散寒止泻为主，同时辅以祛湿、止泻，有补虚而不留邪、标本兼顾之效。为有效控制小儿腹泻凝胶膏质量，建立一种针对有效成分简便、准确的定量测定方法，对于该产品的质控十分必要。吴茱萸为方中君药，含有主要有生物碱类、苦味素类、挥发油类等化学成分[1]。现代药理研究发现，吴茱萸有明显的镇痛、抗炎、止泻及降血压等作用[2]。本试验中建立了小儿腹泻凝胶膏中吴茱萸碱及吴茱萸次碱的含量测定方法，为更好控制小儿腹泻凝胶膏质量提供了参考依据。

1 仪器与试药

Waters e2695 型高效液相色谱仪(四元泵，Waters 2998 型紫外检测器);天津奥特塞斯AT-130 型柱温箱;TU-1810 型紫外分光光度计;AR1140 型电子天平。吴茱萸碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号为110802 -200606，供含量测定用);吴茱萸次碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号为110801 -201006，供含量测定用);小儿腹泻凝胶膏样品(安徽省药物研究所自制，批号为120308，120309，120311);甲醇、乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果[3 -6]

2.1 色谱条件

色谱柱:Cosmosil 5 C18-MS-Ⅱ柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈-水(51 ∶49);检测波长:225 nm;柱温:25 ℃;流量:1.0 mL/min，理论板数按吴茱萸碱峰计应不低于3 000。

2.2 溶液制备

精密称取吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品，加甲醇分别制成每1 mL 含吴茱萸碱0.089 mg、吴茱萸次碱0.025 mg 的溶液，摇匀，即得对照品溶液。取本品4 贴，剪成小块，揭去盖衬，精密称定4 g，剪碎置具塞锥形瓶中，精密加入80%乙醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用80%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按处方量制备缺吴茱萸的空白样品，按供试品溶液制备方法制备吴茱萸阴性对照品溶液备用。

2.3 方法学考察

专属性试验:分别精密吸取2.2 项下3 种溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪。结果吴茱萸碱和吴茱萸次碱与相邻峰的分离度均大于1.5，理论板数按吴茱萸碱峰计不低于3 000。阴性对照品溶液色谱中，在吴茱萸碱和吴茱萸次碱峰位置未见峰出现，认为阴性无干扰，见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:称取吴茱萸碱约2.23 mg 与吴茱萸次碱对照品约1.92 mg，精密称定，分别置25 mL 容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，分别精密吸取吴茱萸碱溶液和吴茱萸次碱溶液1 mL 和2 mL 置10 mL 容量瓶中，0.5，1.0，1.5 mL 置2 mL 容量瓶中，分别用甲醇稀释至刻度，精密吸取上述溶液各10 μL，按拟订色谱条件依法进样测定，记录峰面积。以峰面积积分值(Y)为纵坐标、吴茱萸碱和吴茱萸次碱质量浓度( X)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程，吴茱萸碱为Y =6.0 ×107X -13 702，r=0.999 9( n =5);吴茱萸次碱为 Y =9.4 ×107X +18 236，r=0.999 9( n=5)。结果表明，吴茱萸碱和吴茱萸次碱进样量分别在0.089 ～0.89 μg 和0.077 ～0.768 μg 范围内与峰面积呈良好线性关系。

精密度试验:取同一吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品溶液，按拟订色谱条件注入高效液相色谱仪，连续进样6 次，每次10 μL，记录吴茱萸碱和吴茱萸次碱峰面积。结果吴茱萸碱和吴茱萸次碱的RSD 分别为0.67%和0.71%，表明仪器精密度良好。

重复性试验:取同一批样品(批号为120308)共6 份，依法制备供试品溶液，精密量取该溶液和对照品溶液各10 μL，按拟订色谱条件注入高效液相色谱仪，依法测定。结果吴茱萸碱和吴茱萸次碱的平均总含量为每片0.532 mg，RSD 为0.85% ( n=6)，表明方法重复性良好。

稳定性试验:按2.2 项下方法制备供试品溶液，每隔一定时间按拟订色谱条件重复测定1 次，记录吴茱萸碱和吴茱萸次碱峰面积。结果吴茱萸碱峰面积的RSD 为1.11%，吴茱萸次碱峰面积的RSD 为1.32%，表明供试品溶液在8 h 内稳定。

加样回收试验:取已知含量的同一批样品(批号为120308)2.0 g，精密称定共6 份，置具塞锥形瓶中，再分别加入吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品适量，按供试品制备方法制备待测溶液。精密量取该溶液10 μL，按拟订色谱条件注入高效液相色谱仪，依法测定。结果见表1。

表1 吴茱萸碱和吴茱萸次碱加样回收试验结果(n=6)

2.4 样品含量测定

取3 批样品，依法制备供试品溶液，并按拟订方法进样测定。结果批号为120308，120309，120311 的3 批样品中吴茱萸碱的平均含量为每贴0.518，0.520，0.519 mg，吴茱萸次碱的平均含量为每贴0.526，0.526，0.501 mg。

3 讨论

预试验时，参考文献[7]及《中国药典》[8]中吴茱萸项下含量测定方法，对流动相配比进行了比较，结果表明，以乙腈-水(51 ∶49)为流动相系统最佳，色谱峰的分离度、峰形都较好。

本试验试用了甲醇、无水乙醇和80%乙醇等为提取溶剂，结果表明，以80%乙醇作为提取溶剂，吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量最高，故选择80%乙醇为提取溶剂。

曾比较了80%乙醇回流30，45 min，80%乙醇超声30，45 min，结果以超声30 min 提取为最佳，可完全提取出吴茱萸碱和吴茱萸次碱，故选择超声30 min。本试验方法能够较好地控制小儿腹泻凝胶膏中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量，可作为控制该产品质量的指标。

[1] 战光绪，吴大正，胡之璧. 吴茱萸有效成分的药理研究进展[J]. 上海中医药杂志，2006，4(2):62 -64.

[2] 杨志欣，孟永海，王秋红，等. 吴茱萸药理作用及其物质基础研究概况[J]. 中华中医药学刊，2011，29(11):2 415 -2 417.

[3] 何咏梅，田 静，邓 晶.HPLC 法同时测定吴茱萸中吴茱萸碱、吴茱萸次碱与吴茱萸内酯的含量[J]. 中国药房，2012，23(31):2 944-2 946.

[4] 史万忠，李世芳，刘 瑾，等. 复方灵通胶囊稳定性试验中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量变化[J]. 中成药，2011，33(8):1 356 -1 359.

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[8] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部)[M]. 北京:中国医药科技出版社，2010:160.