参银复智制剂中银杏内酯的提取分离检测＊

王 琳，朱 缨，吴纪凯

(苏州卫生职业技术学院，江苏 苏州 215009)

参银复智制剂是正在研究中的一种用于治疗血管性痴呆的 新型中药复方制剂，其处方组成已向国家知识产权局申请发明专利。银杏叶为组方中的君药，具有多种生理活性，广泛应用于心脑血管疾病和老年性痴呆的治疗和症状改善。其主要有效成分之一为内酯类化合物，包括银杏内酯(ginkgolide) 和白果内酯(bilobalide)两类。银杏内酯是二萜内酯，根据所含羟基的数目和羟基连接位置的差异可分为A，B，C，M，J(ginkgolide A，B，C，M，J)5 种类型，这5 种银杏内酯均为血小板活化因子(PAF)强有力的拮抗剂，其中以银杏内酯B 的活性最强。白果内酯(bilobalide)属倍半萜内酯，具有保护神经的作用，对老年痴呆症有良好的治疗效果。本研究旨在寻找一种从银杏叶中提取、分离、检测银杏内酯和白果内酯且快速简便、适用于大生产的方法，为参银复智制剂的研制提供帮助，也为制备银杏叶提取物的研究提供参考。

1 仪器与试药

液相色谱仪为Waters Acquity UPLC system，包括二元泵处理器、样品处理器、柱温箱、ELSD 检测器以及Empower 色谱工作站;W14M-2 型电子恒温水浴锅(sheldon manufacturing.Inc. );RE200型旋转蒸发仪(瑞士);ZK-2A 型真空干燥器(上海实验仪器厂);CP225D 型电子天平(Sartorius 公司);PB-10 型酸度计(Sartorius);摇床(Labnet orbit LS)。大孔吸附树酯D101，AB-8，D201 及聚酰胺树脂均为工业级;乙腈为色谱纯(Merck 公司)，其他试剂均为分析纯;水为Millipore 超纯水。银杏叶药材由苏州天灵中药饮片公司提供;银杏叶内酯A(GA)、银杏叶内酯B(GB)、银杏叶内酯C(GC)和白果内酯(BB)对照品购至Sigma 公司，纯度均大于98%。

2 方法与结果

2.1 银杏萜类内酯含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱:Waters BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm);流动相:甲醇-四氢呋喃-水(25 ∶5 ∶70);流速:0.3 mL/min;柱温:30 ℃;蒸发光散射检测器(ELSD):漂移管温度80 ℃，载气为氮气，流速2.5 L/min;进样量:5 μL。

2.1.2 线性关系考察

取GA，GB，GC，BB 对照品适量，甲醇溶解，精密吸取混合对照品溶液适量，分别配制成不同质量浓度，按拟订色谱条件依次进样，分别重复3 次。以峰面积积分值(Y)为纵坐标、质量浓度(X)为横坐标进行线性回归。结果见表1。

表1 线性关系考察结果

2.1.3 供试品溶液制备及测定

根据前期正交试验结果及文献[1]报道，选择以下方法提取银杏叶内的内酯类成分:银杏叶适当粉碎，加入7 倍量70%乙醇回流提取2 次，每次3 h，合并提取液，减压回收乙醇，加适量水至3 倍药材量水沉，静置，过滤，浓缩至一定体积，浓缩液低温贮存待用。分别吸取等量浓缩液按1 BV/h 的流速上不同类型树脂柱吸附，先用水洗2 h，取一定浓度的乙醇，按1 BV/h 的流速洗脱，分别收集1 个柱床体积的洗脱液，减压浓缩后以甲醇定容，过0.22 μm 微孔滤膜，即得供试品溶液。按拟订方法测定含量，超高效液相色谱图见图1。

2.2 银杏萜类内酯分离工艺研究

图1 超高效液相色谱图

吸附树脂的吸附性能与被吸附分子的极性、分子大小，以及吸附剂的极性、比表面积、孔径大小等因素有关，且因结构和基团不同或生产厂家不同，吸附树脂的吸附能力也有所区别。为了分离、富集、纯化银杏叶中的萜类内酯，收集了部分国内不同厂家、不同型号的吸附树脂，通过对银杏叶萜类内酯的吸附与分离性能的研究，筛选出较理想的树脂和分离工艺。

大孔吸附树脂预处理:在吸附树脂生产过程中一般均采用工业级原料，产品没有经过进一步净化处理，故吸附树脂内部往往残留少量单体、致孔剂和其他有机物杂质，产品贮存期间为防止细菌、霉菌的生长，有时会加入碱等防腐剂[2]。因此，在树脂使用之前，必须进行预处理，以除去制备和贮存中引入的杂质。一般预处理方法，先是吸附树脂水合(吸附树脂通常以湿态保存，若暴露在空气中则可能部分干燥失水)，为使树脂再度水合，应把脱水的吸附树脂充分浸泡，以便从孔中赶出空气泡;浸泡之后，用水冲洗取代乙醇，水洗可除去痕量的防腐剂和残留的单体化台物。

大孔吸附树脂再生:当树脂的吸附能力降低或受严重污染时需对树脂进行强化再生。在容器内加入高于树脂层10 cm 的3% ～5%盐酸溶液浸泡2 ～4 h，然后进行二次水淋洗，至pH 接近中性;再用3 ～4 倍树脂体积同浓度的盐酸溶液通柱，然后用二次水洗至接近中性;用3% ～5%的氢氧化钠溶液浸泡4 h，后用二次水清洗至pH 为中性，备用即可。取一定量的树脂，用95%的乙醇浸泡24 h，后用乙醇洗涤，直到洗出液中加适量蒸馏水无白色浑浊现象，再用蒸馏水洗至无醇;然后依次用4%NaOH、5%HCL 浸泡2 ～4 h，分别用蒸馏水洗至中性，备用。

吸附树脂装柱步骤:一般吸附柱由玻璃制成。在装柱之前应先在柱中加入一定量的水，然后将带水的吸附树脂浆液倒入柱中，一般按下列步骤进行:树脂-水浆液加入已带有定量水的吸附柱中;把过量的水通过柱底放出，保持水面高于树脂层面3 cm以上，直到所有树脂全部转移到柱中。

吸附树脂选择:分别称取3 g 处理好的AB-8，D101，D201及聚酰胺4 种干大孔树脂，置100 mL 具塞三角瓶中，量取银杏叶提取浓缩液50 mL，置恒温摇床中，25 ℃下以一定的速率振摇24 h后进行过滤，参照2.1 项下方法制备供试品溶液并测定GA，GB，GC，BB 的峰面积，代入相应的线性回归方程计算吸附平衡后溶液中银杏内酯的质量浓度，计算吸附量，吸附量= ( C0- C) × V/m(mg/g)。将吸附平衡的树脂立即放入磨口三角瓶中，精确加入15%乙醇，振荡24 h，再将树脂滤出，测定洗脱液中GA，GB，GC，BB的质量浓度，计算解吸率，解吸率= [ V1C1/( C0- C) V] ×100%。其中，C0和C 分别为树脂吸附前后银杏内酯粗提物液中各萜类银杏内酯的质量浓度，C1为15%乙醇解吸附后溶液中各萜类银杏内酯的质量浓度，V 为银杏内酯粗提物液的体积(50 mL)，V1为洗脱液体积(200 mL)，m 为干树脂质量(3 g)。测定结果见表2。可见，聚酰胺吸附树脂对银杏叶中萜类内酯有较好的吸附作用，加之较高的解吸率(达90%以上)，能起到对银杏叶中内酯类物质的富集纯化作用。因此，选用聚酰胺吸附树脂进行银杏内酯类物质的动态吸附试验。

表2 4 种大孔树脂对银杏叶萜类内酯的静态吸附效果比较

洗脱剂及洗脱浓度选择:内酯类化合物易溶于甲醇、乙醇、丙酮等溶剂，考虑到甲醇的毒性和丙酮的挥发性及溶解性，本试验中采用乙醇-水为洗脱溶剂，对已吸附的树脂按1 BV/h 的流速上柱吸附，先用水洗2 h，再用不同浓度洗脱剂自上而下进行洗脱，分别收集不同浓度洗脱剂的洗脱液，真空干燥，测定萜类内酯的总含量(GA，GB，GC，BB 含量之和)。结果见图2。可见，乙醇浓度在5% ～10%之间基本上可将内酯洗脱下来，而银杏萜类内酯有效部位的含量高，考虑到用5%乙醇洗脱时需较大体积，故采用10%乙醇为洗脱溶剂。

图2 不同浓度洗脱剂的洗脱曲线

洗脱剂用量选择:考虑到洗脱剂对分离效果的影响，分别对10%的乙醇浓度，以1，2，3，4，5 BV 的流速进行试验。结果见表3。从理论上讲，洗脱剂用量越多越好，但过量的洗脱剂后处理较麻烦，起不到浓缩效果，且过量的溶剂会将银杏叶内的其他成分洗脱下来，从而降低银杏萜类内酯的纯度。由表3 可知，2 ～3 倍的洗脱剂用量已能将内酯洗脱下来。

2.3 最佳分离工艺条件验证

上述试验确定的最佳工艺条件为，银杏叶采用7 倍70%乙醇回流提取2 次，每次3 h，合并提取液，减压回收乙醇，加3 倍量水，水沉，过滤，浓缩，然后上已处理好的聚酰胺树脂，2 倍水洗后，用2 ～3 倍树脂床体积的10%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩干燥。按此条件试制3 批样品，检测含量。结果银杏萜类内酯的含量都在35%以上，有效部位得率在90%以上，与所用银杏叶原料中有效成分含量成正相关。因此，该工艺技术稳定可靠，能较经济地达到有效分离银杏萜内酯的目的。

表3 洗脱剂用量对洗脱效果的影响

3 讨论

与高效液相色谱(HPLC)法比较，超高效液相色谱-蒸发光散射(UPLC-ELSD)法在检测银杏叶萜类内酯时具有超高分离度、超高速度、超高灵敏度等优点[3]。常规HPLC 法测定银杏中萜类内酯的含量一般需要0.5 ～1 h，样品组分才能得到较好的分离，而采用UPLC 法只需15 min 就能得到更好的分离效果和分析结果。本试验中只采用一次柱分离、结晶纯化，即可连续制得纯度达35%以上的银杏萜类内酯。本工艺操作中，只采用无毒试剂水和乙醇，对产品药用提供了安全保障。由于采用的是可重复使用的大孔树脂，使生产成本大大降低，且工艺简便，采用有机试剂少，因此适用于中试及工业生产，且为大规模开发银杏萜内酯药品奠定了良好的基础。

[1] 陈 红，孙黎清，董自波. 银杏叶总黄酮苷和萜内酯类化合物最佳提取工艺研究[J]. 中国药业，2007，16(14):47 -48.

[2] 苏 静，谈 锋，李连强，等. 高速逆流色谱法分离纯化银杏叶中白果内酯和银杏内酯A、B、C[J]. 中草药，2008，39(11):1 644 -1 648.

[3] 赵一懿，郭洪祝，王京辉，等. 超高效液相色谱法同时测定银杏叶提取物中11 种黄酮苷类成分的含量[J]. 中国药学杂志，47(24):2 032 -2 037.