罗汉松种子提取物对人胃癌细胞的体外抑制作用

周 燕，隗 磊，谭志明，余尚工，方念伯，刘合刚

(1. 湖北中医药大学中药资源与中药复方教育部重点实验室，湖北 武汉 430065;2. 全南厚朴生态林业有限公司，江西 赣州 341000)

罗汉松科植物罗汉松 Podocarpus macrophyllus (Thunb. )D.Don 是松树的一种，又名罗汉杉、长青罗汉杉、土杉、金钱松、仙柏、罗汉柏、江南柏，为常绿乔木。研究表明，罗汉松属植物所含的双黄酮、芹菜素等成分对胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等癌症均有一定的防治作用[1-2]。目前尚未见罗汉松种子提取物体外抗肿瘤方面的研究，故本试验中以人胃癌细胞MGC-803 为研究对象，探讨罗汉松种子提取物对肿瘤细胞的生长抑制作用，为进一步研究其抗肿瘤机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与细胞

BC-R1001A 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);FD-12HL 型超低温冷冻干燥机(北京东方精瑞科技发展有限公司);BHC-1300 ⅡA/B 型生物安全柜(苏净集团安泰公司);NU-5510E46603 型CO2培养箱(美国NUAIRE);XD-101 型倒置显微镜(南京江南永新光学有限公司);全自动酶标仪(Sunrise，瑞士TECAN 公司);一次性培养瓶、96 孔板(Corning 公司);AB-135 -S 型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司);TDZ5 -WS 型低速离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司);WD-9405B 型水平摇床(沃德生物医学仪器公司);SP-756P 型紫外分光光度计(上海市光谱仪器有限公司);PCR 仪(Bio-RAD，伯乐公司);FluorChem Q 型多色荧光、化学发光凝胶成像系统(美国Protein Simple 公司)。乙醇为分析纯(国药试剂有限公司);DMEM 培养基(Corning 公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);双抗(吉诺生物医药技术有限公司);0.25%胰蛋白酶(吉诺生物医药技术有限公司);PBS(吉诺生物医药技术有限公司);二甲基亚砜(DMSO，科瑞生物);噻唑蓝(MTT，科瑞生物科技有限公司);总RNA 提取试剂盒(日本Bioflux 公司);逆转录试剂盒(MBI Fermantas 公司);荧光染料(伯乐公司);DEPC 水、琼脂糖、Tris-base、硼酸、DNA 上样缓冲液、EDTANa2及Gelred(美国Amresco 公司);罗汉松种子(全南厚朴生态林业有限公司)。人胃癌MGC-803 细胞(安徽中医学院李庆林教授提供)。

1.2 方法

罗汉松种子提取物制备:取3.14 kg 罗汉松种子，粉碎后加入3 倍量95%的乙醇热回流提取，提取3 次，每次2 h，趁热过滤，合并所得滤液，减压浓缩，冷冻干燥得冻干粉，-80 ℃保存备用。

细胞培养:MGC-803 细胞置于37 ℃、饱和湿度、含5%的CO2培养箱中培养，培养液DMEM 含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL 链霉素。根据细胞生长状态每2 ～3 d 传代1次。取生长状态稳定呈对数生长期细胞用于试验。

试验分组:分为罗汉松种子提取物处理组(试验组)和空白对照组。试验组精密称取罗汉松种子提取物冻干粉2.0 mg，加10 μL DMSO 及990 μL DMEM 使其溶解，过滤，得到罗汉松种子提取物贮备液，精密吸取贮备液50，100，200 μL，分别置离心管中，再分别加入DMEM 定容，使其终质量浓度为25，50，100 μg/mL;空白对照组只加DMEM 培养液。

MTT 试验:取处于对数生长期的MGC-803 细胞，调整细胞密度至2×105个/mL，接种于96 孔板中，每孔100 μL，每组设5个复孔。置37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h 后吸出原培养液，加入含有不同质量浓度(0，25，50，100 μg/mL)罗汉松种子提取物的培养液200 μL，继续培养24，48，72 h 后，每孔加入MTT 溶液(5 g/L)10 μL，继续培养4 h，终止培养。小心吸弃孔内培养液，每孔加入DMSO 100 μL，置水平摇床低速震荡10 min，使结晶充分溶解。选择酶标分析仪490 nm 波长测定每孔吸光度值(OD 值)，试验重复3 次。肿瘤细胞生长抑制率(%)=(1-试验组吸光度值/对照组吸光度值)×100%。

RT -PCR 检测罗汉松种子提取物对MGC -803 细胞凋亡相关基因表达的影响:用胰酶消化收集0，25，50，100 μg/mL 4 个不同质量浓度罗汉松种子提取物作用48 h 后的MGC -803 细胞，采用Simply P 总RNA 提取试剂盒提取总RNA，紫外分光光度法测定RNA 的纯度，进行RT -PCR，检测细胞凋亡相关基因bcl-2 和p53 的表达。bcl-2 基因的引物序列，F 为5' -AGAGTGCTGAAGATTGATTGATGGGAT-3'，R 为5' -CTTTGCATTCTTGGACGAGG -3'，扩增片段274 bp。P53 基因的引物序列为F:5'-CCTCCTCAGCATCTTATCCG-3'，R 为5'-TTCCGTCCCAGTAGATTACCA -3'，扩增片段236 bp。β -actin 基因的引物序列，F 为5'-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3'，R 为5'-CACCTTCACCGTTCCAGTTT -3'，扩增片段190 bp。扩增条件为预变性94 ℃5 min;40 个循环，变性94 ℃30 s，退火59 ℃45 s，延伸72 ℃45 s;加长延伸72 ℃5 min。扩增结束后将目的基因置1.2%的琼脂糖凝胶水平电泳槽内电泳，电泳完毕后在多色荧光、化学发光凝胶成像系统中拍照分析。以β-actin 为内参，用2-ΔΔCT 值来表示基因的相对表达量。

1.3 统计学处理

采用SPSS 16.0 统计软件对试验数据进行统计学分析。细胞的生长抑制率以百分率表示，两组间比较采用t 检验;细胞凋亡相关基因的相对表达量采用单因素方差分析(one-way-AVOVA)，组间比较用LSD 法。试验结果以± s 表示，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对MGC-803 细胞的增殖抑制作用

与对照组比，质量浓度分别为25，50，100 μg/mL 的罗汉松种子提取物作用MGC-803 细胞24，48，72 h，细胞增殖抑制率显著增加(P ＜0.01)。随着作用时间延长，药物对MGC-803 的生长抑制作用增强，并呈一定的时效关系;随着作用浓度的增大，药物对MGC-803 细胞的生长抑制作用也明显增强，并呈浓度依赖性。见表1。

表1 不同质量浓度罗汉松种子提取物对MGC-803 细胞增殖抑制的影响(n=5)

2.2 细胞凋亡相关基因bcl-2 及p53 的表达

提取的各组细胞的mRNA OD260/ OD280比值均在1.8 ～2.0之间，说明RNA 纯度较高，可用于后续试验。目的基因扩增曲线平滑，溶解曲线为特异单峰。给药48 h 后，bcl -2 基因表达显著下调，并表现出明显的剂量依赖性，与空白对照组比较，给药25 μg/mL，bcl -2 mRNA 表达水平显著降低(P ＜0.05);给药50，100 μg/mL，bcl-2 mRNA 表达水平极降低更显著(P ＜0.01)。p53 基因则随给药质量浓度的增加而表达增多，与空白对照组比较，给药100 μg /mL 能显著上调p53 mRNA 的相对表达量(P ＜0.05)。见图1 和图2。

图1 bcl-2、p53 mRNA RT-PCR 结果

3 讨论

胃癌为常见的恶性肿瘤之一，据世界卫生组织公告，居世界癌症死亡率第2 位。我国的胃癌高发，患病率和死亡率均是世界平均水平的2 倍多。目前，临床上治疗胃癌主要采用外科切除、药物化学治疗、放射治疗，但其对机体均会带来一定损伤和毒副作用。中药在改善患者体质、降低化学治疗药物毒性等方面有突出作用。本试验通过观察不同质量浓度罗汉松种子提取物对人胃癌细胞体外生长、增殖、凋亡的影响，探讨了其对人胃癌细胞抑制作用及相关机制。结果表明，药物在体外能明显抑制胃癌细胞MGC-803 的增殖，且其抑制作用呈质量浓度和时间依赖性。bcl-2 基因位于18q21，可对多种因素诱导的细胞凋亡起抑制作用，其表达在胃肿瘤的发生、发展中起着重要作用。bcl-2 蛋白在胃癌组织呈高表达，并在高、中分化胃癌中表达率高于低分化胃癌，提示bcl-2 通过抑制细胞凋亡进而促进胃癌发生。本试验结果表明，罗汉松种子提取物作用于MGC-803 细胞48 h，凋亡抑制基因bcl-2 表达呈显著性下降。因此，罗汉松种子提取物可能是通过抑制凋亡抑制基因bcl-2 的表达，继而抑制bcl-2 蛋白的表达，从而抑制线粒体通透性转换孔(PTP)开放，继而抑制凋亡通道下游Caspase 的活性，来发挥诱导凋亡的作用。p53 基因最早发现于1979 年，最初被认为是一种有显性转化作用的内核癌基因。直到1988 年，才提出p53 基因是一种肿瘤抑制基因。该基因位于17p13，它可与多种癌基因和生长因子协同调节细胞周期。在细胞发生DNA 损伤时，p53 蛋白能使细胞分裂终止在G1/S期，使细胞有足够时间修复损伤，恢复正常状态。若不能修复，野生型p53 基因能启动细胞的凋亡过程，从而引发细胞的程序性死亡，阻止具有癌变倾向的突变细胞产生[3]。野生型p53 基因的功能丧失或突变会导致异常的细胞周期恶性循环，使细胞失控，从而形成恶性肿瘤。本研究发现，药物作用48 h 后，与空白对照组比较，给药100 μg/mL 时p53 基因表达水平显著增加(P ＜0.05)。综上所述，罗汉松种子提取物对MGC-803 细胞具有增殖抑制作用，可能与调控相关凋亡基因有关。

[1] 张 博. 罗汉松属植物双黄酮成分及药理活性研究进展[J]. 首都医药，2010，17(14):67 -69.

[2] 林丽文，辛 勤. 芹菜素抗癌作用研究进展[J]. 济宁医学院学报，2010，33(3):221 -223.

[3] 韩 涛，杨德吉.P53 基因与肿瘤形成[J]. 动物医学进展，2008，29(4):88 -92.