可断裂聚乙二醇和穿膜肽共修饰脂质体肿瘤靶向作用初步研究

石志蓉，肖羽君

(1. 广东省珠海市第二人民医院药剂科，广东 珠海 519070; 2. 联邦制药有限公司中山分公司，广东 中山 528400)

肿瘤是目前全球致死率排名第2 的疾病，目前临床的主要治疗方法有化学治疗(简称化疗)、手术、放射治疗(简称放疗)、中药、免疫、分子靶向等。化疗是临床应用最广泛的治疗手段，但全身不良反应较明显，给患者造成了较大痛苦[1]。20 世纪初，部分学者对药物靶向治疗展开了研究，有望进行选择性给药，对于提高治疗效果、降低不良反应均有重要意义。其中，脂质体以其疏水、亲水双构造特性在许多疾病的治疗中受到了广泛关注[2]。笔者探讨了可断裂药用聚乙二醇(PEG)和穿膜肽(TAT)共修饰脂质体用于肿瘤靶向治疗的效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

试剂包括大豆卵磷脂、胆固醇、1640 培养基、TritonX-100、Sephadex-G50、胎牛血清、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、牛血清白蛋白等，均购自专业生产厂家。脂质体制备设备为ZHWY-100H型恒温空气摇床、RE-200B 型旋转蒸发仪、恒温水浴锅、AL204-IC 型电子天平、超声细胞粉碎机等，检测观察设备为RF-5301 型荧光分光光度计、Sizer Nano ZS90 型激光粒度仪、ZETA 电位分析仪、倒置荧光显微镜、Agilent 6410 型质谱仪、HPLC/LC/24-AD 型高效液相色谱仪、ELX800 型酶标仪等。

1.2 脂质体制备

脂质体制备采用薄膜分散-超声法。取SPC，CHo，DSPEPEG-TAT，DSPE-PEG-OMe 等，剂量参照文献[3]。将上述药剂置50 mL 茄型瓶中，加入氯仿进行溶解，旋转、蒸发后置真空干燥器中，24 h 后加入pH 为7.4 的磷酸盐缓冲液(PBS)2.5 mL，并将所得物质置入37 ℃恒温空气摇床中，以180 r/min 的速率离心20 min 后，水化10 min，水浴超声脱膜5 min，并使用超声探头(80W)扫描15 次，每次5 min，即得所需可断裂PEG 和TAT 共修饰脂质体。

1.3 观察项目

1.3.1 质谱鉴定

使用LA-24AD 型高效液相色谱仪进行粗分离，使用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法检测纯度后，收集主峰，参照文献[4]进行质谱鉴定。鉴定参数:曲形脱溶剂装置(CDL)250 ℃;电压:检测器1.5 kV，探针4.5 kV，CDL-20 V;流速:雾化器1.5 L/min;流动相:0.2 mL/min;全扫描质量范围:400 ～1 500 m/z。

1.3.2 体外活性

取SMMC-7721 人肝癌细胞株及LO2 人正常肝细胞株，分别纳入观察组及对照组，均将其培养至90%汇合后，使用PBS 漂洗2 次，接种于12 孔板，接种密度为5×104个/孔，每孔再加入DMEM(含共修饰脂质体100 μg /mL)，孵育3 h 后用PBS 漂洗5次，加入4%多甲醛进行细胞固定，观察其体外活性。

1.3.3 细胞生物学活性

将SMMC-7721 人肝癌细胞株接种于12 孔板，接种密度为5 ×103个/孔，培养12 h 后，分别向各孔加入共修饰脂质体，质量浓度依次为0，20，40，80，100，120，140，160，180 μg/mL，用酶标仪观察各质量浓度溶液490 nm 波长处的吸光度(D490)[5]。

1.4 统计学处理

数据采用SPSS 13.0 统计软件进行分析，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t 检验。检验水准设定为α=0.05，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 质谱鉴定结果

经鉴定，合成的共修饰脂质体杂质较少，其相对分子质量约为3 622.4，纯度约为96.1%，图像表现为主峰峰面积较高，见图1。

2.2 体外活性观察结果

白色光、荧光及重叠后，观察组均可见胞内红色细胞大量分布，且集中于胞质内。见图2。

图1 共修饰脂质体高效液相色谱图

图2 共修饰脂质体的体外活性

2.3 细胞生物学活性观察结果

不同质量浓度共修饰脂质体对SMMC-7721 的细胞生物学活性影响与对照组比较，无明显差异，见表1。

表1 共修饰脂质体对SMMC-7721 细胞生物学活性的影响(± s)

表1 共修饰脂质体对SMMC-7721 细胞生物学活性的影响(± s)

组别对照组观察组质量浓度(μg/mL)0 20 40 60 80 D490 D490 0.210 70±0.017 64 0.023 51±0.019 50 0.023 28±0.003 98 0.230 90±0.015 34 0.214 80±0.025 88组别观察组质量浓度(μg/mL)100 120 140 160 180 0.238 10±0.039 08 0.024 09±0.001 97 0.023 50±0.016 30 0.023 59±0.011 94 0.229 80±0.013 85

3 讨论

临床肿瘤治疗最常见的手段是化疗，但多种化疗药物在消灭肿瘤细胞时对患者正常细胞也造成了极大损害，常引发骨髓抑制、免疫下降甚至心血管系统、消化系统毒性，使患者治疗耐受性大幅下降，影响了治疗依从性及治疗效果[6]。因此，寻找合适的脂质体携带药物到达肿瘤位置进行靶向治疗一直是医学研究的重点。

笔者参考在前人研究的基础上制备了可断裂PEG 和TAT 共修饰脂质体，其依据主要为:可断裂PEG 能够使脂质体的作用时间延长，且能够帮助其越过网状内皮吞噬环节，并增强携带药物的渗透作用，具有较佳的肿瘤靶向性;TAT 又称蛋白转导域，具有亲水、疏水两端，能够促进药物的细胞内摄取;PEG 对脂质体与肿瘤细胞的作用存在影响，同时，TAT 选择特异性较差，不利于其在肿瘤内的长期蓄积[7]。因此，将可断裂PEG 及TAT 制备为共修饰脂质体，有望达到协同作用的目的，发挥二者的优势。

由质谱鉴定结果可见，合成的共修饰脂质体杂质较少，其相对分子质量约为3 622.4，纯度约为96.1%，提示可断裂PEG 和TAT 合成纯化效果十分明显，与预期理论相对分子质量3 622.37无明显差异，合成效果理想。体外活性观察可见，白色光、荧光及重叠后观察组均可见胞内红色细胞大量分布，且集中于胞质内，这表明共修饰脂质体具有较佳的体外活性，即共修饰脂质体可选择性进入肿瘤细胞，而不会进入正常细胞株，显示了其良好的细胞靶向性[8]，且合成的共修饰脂质体进入肿瘤细胞后多集中于细胞质位置，有利于靶向药物作用的发挥，具有良好的临床应用前景。为进一步分析该共修饰脂质体的安全性，笔者对靶向细胞活性的变化进行了分析，并发现不同质量浓度共修饰脂质体对SMMC-7721 细胞生物学活性与对照组比较无明显差异，提示共修饰脂质体的质量浓度不会影响细胞的活性，不会引发细胞活性改变，进而有效地防止了细胞毒性反应的发生[9]，具有良好的安全性。此外，Cole 等[10]指出，可断裂PEG 能促进共修饰脂质体通过正常毛细血管壁，减少了携带药物在其他非靶向部位的分布。这也大大降低了药品不良反应的发生率，且在保护心肌方面作用最显著[11-13]。

综上所述，可断裂PEG 和TAT 共修饰脂质体的稳定性较高，制备工艺便捷，具备良好的药物承载性和安全性，且存在良好的细胞内外传递潜能，肿瘤靶向性极佳，具有良好的临床应用前景，值得进一步研究。

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