新型食品添加剂LfcinB对肿瘤细胞生长的抑制作用

韩兆莲，许晓曦

（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

新型食品添加剂LfcinB对肿瘤细胞生长的抑制作用

韩兆莲，许晓曦*

（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

研究了LfcinB作为免疫强化剂以及营养强化剂对肿瘤细胞的抑制作用。主要应用CCK-8法检测LfcinB对人T淋巴细胞白血病细胞（Jurkat细胞）活力的影响，应用双标记流式细胞术分析LfcinB抑制Jurkat细胞生长的作用方式。研究结果证实，LfcinB对Jurkat细胞增殖的影响与LfcinB的作用时间和浓度呈正相关，而且LfcinB主要时通过诱导Jurkat细胞发生早期凋亡来抑制其增殖，并且其诱导Jurkat细胞早期凋亡的最佳浓度和时间分别为200μg/mL和48 h。

牛乳铁蛋白素；Jurkat细胞；细胞凋亡

牛乳铁蛋白素（LfcinB）是牛乳中乳铁蛋白在酸性环境下经胃蛋白酶作用N端释放的一小段具有广谱抗菌作用的生物活性肽。乳铁蛋白素作为食品保存剂、抗氧化剂、营养强化剂、免疫强化剂、免疫调节剂等在食品领域得到广泛的应用[1]。LfcinB不含稀有氨基酸和外源化学成分，是健康安全的天然物质。LfcinB作为食品添加剂可调节机体免疫系统活性，增强对疾病的抵抗力[2]；提高产品乳化性能，促进脂肪消化吸收[3]；具有广谱的抗菌性和抗脂质氧化的作用[4-5]，故可用作防霉剂和抗氧化剂。近期研究，LfcinB对肿瘤细胞也具有一定的抑制作用[6-12]。本实验深入探讨了LfcinB抑制肿瘤细胞生长的作用机理，为LfcinB在食品中，特别是保健食品中作为营养强化剂、免疫强化剂、免疫调节剂等的应用提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

Jurkat，Clone E6-1人T淋巴细胞白血病细胞（细胞编号TIB-152）：美国菌种保藏中心；LfcinB（氨基酸序列FKCRRWQWRM KKLGA PSITCVRRAF）：上海楚肽生物技术公司。

1.2 细胞培养

Jurkat细胞培养在含有10%热灭活胎牛血清的RMPI1640完全培养基中，培养温度为37℃，CO2浓度为5%，隔天换液，以保持细胞最佳生长状态，细胞在进行实验前均采用血清饥饿法处理24 h。

1.3 CCK-8法检测LfcinB对Jurkat细胞增值抑制率的影响

1.3.1 CCK-8法

将药物刺激后的细胞移入96孔细胞培养板中，按照试剂盒操作说明每孔添加适量的CCK-8试剂，在培养箱中继续培养1 h，酶联免疫检测仪450 nm处检测各孔的吸光度值，并计算增殖抑制率。

1.3.2 LfcinB的浓度对Jurkat细胞增值抑制率的影响

Jurkat细胞分别在浓度为0、50、100、200、400μg/mL的LfcinB培养基中培养24 h后，利用CCK-8法测定增值抑制率，每组实验平行4次。

1.3.3 LfcinB的作用时间对Jurkat细胞增值抑制率的影响

Jurkat细胞在浓度为200μg/mL的LfcinB培养基中分别培养24、48、72 h后，利用CCK-8法测定增值抑制率，每组实验平行4次。

1.4 Annexin-FITC/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡

1.4.1 Annexin-FITC/PI双标记流式细胞术

不同分组的LfcinB作用Jurkat细胞后，加入195μL Annexin-FITC结合液和5μL Annexin-FITC染色液，室温避光孵育45min，然后离心收集细胞并加入190μL Annexin-FITC结合液和10μLPI染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置，每个EP管最终的体积为500μL，上机前用200目筛网进行过滤，随即进行流式细胞仪检测。

1.4.2 LfcinB的浓度对Jurkat细胞早期凋亡的影响

Jurkat细胞分别在浓度为0、50、100、200、400μg/mL的LfcinB培养基中培养24 h后，按照上述方法处理，利用流式细胞仪检测Jurkat细胞的早期凋亡率。

1.4.3 LfcinB的作用时间对Jurkat细胞早期凋亡的影响

Jurkat细胞在浓度为200μg/mL的LfcinB培养基中分别培养24、48、72 h后，按照上述方法处理，利用流式细胞仪检测Jurkat细胞的早期凋亡率。

1.5 统计学处理

应用SPSS17.0软件进行多实验组均数与对照组均数比较的ANOVA中的Donnett-t检验。

2 结果

2.1 LfcinB的浓度对Jurkat细胞增值抑制率的影响

不同浓度的LfcinB对Jurkat细胞增殖的影响不同，结果见图1。

从图1中可以得出，Jurkat细胞的增值抑制率是随着LfcinB浓度的增加而增加，即Jurkat细胞的活性随着LfcinB浓度的增加而降低。结果显示，浓度为200μg/mL和400μg/mL的LfcinB对Jurkat细胞的增殖抑制率较高，然而这两个浓度对细胞产生的增值抑制率差距不大，从节约原料的角度出发，选择浓度为200μg/mL作为LfcinB的最佳抑制浓度。

图1 不同浓度的LfcinB对Jurkat细胞增殖的影响Fig.1 Effectsof different LfcinB concentration on Jurkat cells

2.2 LfcinB的作用时间对Jurkat细胞增值抑制率的影响

图2为LfcinB作用时间不同的Jurkat细胞增值抑制率。

图2 LfcinB的作用时间对Jurkat细胞增殖的影响Fig.2 Effectsof different LfcinB action timeon Jurkat cells

由图2可知，随着作用时间的增加，LfcinB对Jurkat细胞的增值抑制率有所增加，但增加幅度不大。即LfcinB的作用时间对增值抑制率的影响不大。

2.3 不同浓度的LfcinB对Jurkat细胞早期凋亡率的影响

图3为不同浓度的LfcinB作用Jurkat细胞24 h后早期凋亡率的结果。

由图3可知，在同一作用时间内，Jurkat细胞的早期凋亡率随着LfcinB浓度的增大而增加，但是200μg/mL和400μg/mL组Jurkat细胞的早期凋亡率差异不显著。

2.4 LfcinB的作用时间对Jurkat细胞早期凋亡率的影响

图4是浓度为200μg/mL的LfcinB作用Jurkat细胞不同时间后早期凋亡率的结果。

由图4可知，对于同一作用浓度，不同作用时间的LfcinB来说，72 h时Jurkat细胞的早期凋亡率（Q4）较前两个时间比较，有所降低，此结果表明，LfcinB作用诱导Jurkat细胞早期凋亡的最佳作用时间为48 h，而晚期凋亡或坏死细胞（Q2）的比例却有所增加。

图3 不同浓度的LfcinB对Jurkat细胞早期凋亡的影响Fig.3 Effectsof different LfcinB concentration on early apop tosisof Jurkat cells

图4 LfcinB的作用时间对Jurkat细胞早期凋亡的影响Fig.4 Effectsof different LfcinB action tim eon early apoptosisof Jurkat cells

3 讨论

LfcinB对膀胱癌、肺癌、食道癌及肿瘤转移的预防与抑制作用在1999年被Ushida所证明[13]，但作用机制尚未完全证实。本实验利用CCK-8法和双标记流式细胞术分析得出LfcinB是通过促进Jurkat细胞发生早期凋亡来抑制Jurkat细胞生长达到抗肿瘤作用，对LfcinB抗肿瘤机制进行了初步探究，此结果为LfcinB作为免疫强化剂以及营养强化剂对肿瘤细胞的抑制作用的应用提供了理论依据。

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[13]Ushida Y.Possible chemopreventive effectsof bovine lactoferrin on esophagus and lung carcinogenesis in the rat[J].Jpn JCancer Res, 1999,90:262-267

Inbibitional Effects of LfcinB as One New Food Additives on Cell Grow th of Cancer

HAN Zhao-lian，XUXiao-xi*

（College Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，Heilongjiang，China）

Inhibition ofcancer cells from LfcinBas immune-enhancerand nutrientsupplementswas researched. Thisexperimentmeasured thevitalityof Jurkatcellsby CCK-8 and analysed themodeofaction from LfcinBeffect to human acute T lymphocyte leukemia cells（Jurkatcells）by doublemarker flow cytometry.According to the results，the effects of LfcinB to Jurkat cells on proliferation inhibition were positively related to the action concentration and time.And the proliferation inhibition of Jurkatcellsby LfcinBwasmainly induced by the early apoptosisratio，and thebestconcentrationand timetoinduce Jurkatcellsearlyapoptosiswas200μg/mLand48h.

Lfcin B；Jurkatcell；apoptosis

2013-12-12

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.005

韩兆莲（1986—），女（满），硕士研究生，主要研究方向：乳品营养与安全。

*通信作者